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鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由鸡的传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起鸡的一种急性上呼吸道病毒性疾病。该病的防控主要依靠疫苗免疫,但是商品弱毒活疫苗存在毒力返强的问题,而表达ILTV免疫原基因的活载体疫苗有着免疫起效时间长且保护不完全的缺点。ILTV基因缺失疫苗具有弱毒活疫苗同样的免疫原性,同时可以表达其他病毒抗原,有较好的应用前景。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的新城疫(Newcastle disease,ND)是禽的另外一种烈性呼吸道传染病。该病遍布全世界,疫苗免疫是控制该病的主要措施。目前应用的活疫苗虽然能够对所有的NDV强毒株感染提供临床保护,但是如果免疫鸡群感染其他基因型强毒株,强毒株会在鸡体内的复制并排毒,造成生物安全隐患。中国目前流行的NDV主要是基因Ⅶ型病毒,因此研发针对该型病毒的疫苗具有重要意义。本研究以本实验室分离的ILTV弱毒株ck/CH/LHLJ/120305(LHLJ/120305)作为亲本毒,采用同源重组技术,首先利用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)替换ILTV的gC蛋白基因,构建基因缺失株,命名为ILTV-ΔgC-EGFP。应用该毒株感染细胞后,在荧光显微镜下可见明显绿色荧光,表明重组病毒感染细胞后可以有效表达外源蛋白。本研究进一步以ILTV-ΔgC-EGFP株为基础,利用中国流行的NDV Ⅶ型ck/CH/LHLJ/01/06(LHLJ/01/06)F蛋白基因替换EGFP基因,构建了一株表达NDV F蛋白的重组病毒,命名为ILTV-?gC-F株,并对重组病毒的生物学特性进行了研究。在此基础上,为了评价ILTV-ΔgC-F株的致病性和免疫原性,将重组病毒人工接种无特定病原体(Specific pathogen-free,SPF)鸡,接种后20d未见临床症状,证明了ILTV-ΔgC-F株对SPF鸡无致病性,具有较好的安全性。通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测SPF鸡抗体产生情况,结果表明重组病毒可以诱导SPF鸡产生ILTV特异性血清抗体,抗体水平与亲本病毒LHLJ/120305基本一致。在免疫后21 d用ILTV WG株攻毒后观察20 d,未见任何临床症状,ITPI评分为0。应用荧光定量PCR检测攻毒后排毒和靶器官病毒复制情况,结果表明仅仅有少数的SPF鸡在感染早期检测到呼吸道的病毒排毒和靶器官病毒复制,但对强毒ILTV的攻击提供了完全的临床保护作用。对免疫鸡进行NDV抗体水平检测和NDV强毒株LHLJ/01/06的攻毒保护试验,应用rRT-PCR检测攻毒后排毒和靶器官病毒复制情况。结果表明,ILTV-ΔgC-F株单次免疫后产生的NDV血清抗体水平较低(40%),但是却能提供完全的临床保护。而且免疫组鸡咽肛拭子和靶器官中的病毒载量明显低于对照组鸡。综上所述,本次试验成功构建的ILTV-ΔgC-F株免疫SPF鸡可以抵抗NDV和ILTV强毒株的攻击,ILTV-ΔgC-F株可以作为NDV和ILTV二联活载体疫苗的候选毒株。在理论上可以同时区分NDV和ILTV疫苗株和野毒株,具有区分感染动物和疫苗接种动物策略(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA)疫苗的功能。