拟南芥RH20调控DNA损伤修复作用机制研究

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DNA损伤修复应答(DNA damage response,DDR)是生物体在暴露于内源或外源DNA损伤因子时维持基因组稳定性的重要调控机制。植物的固着性和对光合作用的强制依赖性,使得植物很容易遭受到DNA损伤,因此植物中的DNA损伤修复机制的存在显得尤为重要。但是目前对于DNA损伤修复机制的研究主要集中于酵母和动物系统中,植物中尚未有深入研究。根据酵母和动物系统中的研究现状,我们发现在植物中研究动物的DDR通路同源基因的功能是一个非常有意义的研究,也是一个很好的切入点,将会产生相互促进和借鉴的作用。DDX5(p68)是动物DDR系统内一个关键的调节因子,通过对p53功能的调节,参与动物内DNA损伤修复反应。但是在植物内DDX5同源基因的相似功能却未有研究。本研究分析发现了拟南芥中的RH20为DDX5的同源基因。因此本论文对拟南芥中RH20在DDR通路内的功能进行研究并获得以下结果:(1)RH20在植物各组织中均有表达,其中在花中的表达最强。对其亚细胞定位研究发现,RH20在细胞质与细胞核中均有表达,但主要富集在核仁中;(2)用博来霉素Zeocin处理植物引发的DNA损伤对RH20转录本积累无明显影响,但其蛋白水平的积累显著提高;(3)用博来霉素处理野生型和rh20突变体后发现,相较于野生型植物,rh20突变体呈现出明显的DNA损伤表型,包括萌发时真叶数量明显减少和根长明显缩短等,并利用碘化丙啶对博来霉素处理后的细胞死亡区域进行染色,rh20突变体的细胞死亡区域明显大于野生型植物,说明RH20的突变不利于植物对DNA损伤的修复,即RH20具有一定的DNA损伤修复作用。(4)DNA损伤修复过程中,如BRAC1、RAD51和WEE1等基因的积累显著增加。为了探索RH20如何参与DNA损伤修复通路,本研究利用荧光定量PCR对DNA损伤修复通路中基因的表达水平进行检测,结果表明,RH20突变不影响DNA损伤通路中重要基因的积累,即RH20并非通过调节DNA损伤通路中基因的表达,参与到DNA损伤修复通路中。(5)为进一步探索RH20参与DNA损伤修复的机制,本研究利用免疫沉淀-质谱联用技术来鉴定可能与RH20互作的蛋白并对IP-MS文库内蛋白质的功能进行分析,筛选出多个可能参与到DNA损伤修复的蛋白,如CDKA1、MAPK12、EIF4A-2和CDC48A等。(6)在植物内检测RH20与CDKA1和MAPK12的相互作用时发现,CDKA1和RH20存在相互作用。因此,RH20可能通过与CDKA1的相互作用参与到DNA损伤修复过程中。在动物中,CDKA1通过调节下游蛋白的磷酸化影响生物体的DNA损伤修复,论文进一步研究发现RH20突变后,H1 Thr3的磷酸化水平显著降低。这些结果表明,RH20可能通过调节CDKA1对下游蛋白的磷酸化水平,参与到DNA损伤修复中。综上所述,本论文通过系列研究,发现了DDX5在植物中的同源基因RH20,该基因编码的蛋白可能通过与之互作的CDKA1蛋白,调控H1 Thr3的磷酸化,进而调节植物DNA损伤修复。这些结果对揭示植物内的DNA损伤修复机制具有一定意义。
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