论文部分内容阅读
目的在前期研究的基础上,进一步探讨β淀粉样蛋白(Aβ)介导的大鼠学习记忆损伤和神经细胞氧化损伤的神经毒性作用及其机制,并分析大豆异黄酮联合叶酸对Aβ神经毒性的干预作用及其机制,为大豆异黄酮联合叶酸有效预防和控制阿尔茨海默病提供科学的实验数据和基础理论依据。方法1.体内实验选用SPF级别的Wistar大鼠(雄性,体重230g～280g,3月龄),用脑立体定位仪,在大鼠侧脑室注射Aβ多肽片段(Aβ1-40,Aβ25-35,Aβ31-35)建立动物氧化损伤诱导的学习记忆损伤模型。大鼠随机分为对照组、模型组、大豆异黄酮(160mg/kg·bw·day)单独干预组、叶酸(0.7mg/kg·bw·day)单独干预组和二者联合干预组,共5组,每组15只。干预组大鼠从Aβ侧脑室注射前14天起,用大豆异黄酮和叶酸分别进行单独和联合干预实验,每日灌胃一次,连续三周。1)术后第8天,通过Morris水迷宫试验来检测大鼠的神经行为学改变;2)术后第14天,各组随机处死3只大鼠,通过免疫组织化学方法检测大脑皮层和海马的病理学改变;3)实验结束,处死大鼠并迅速分离脑、心脏以及肝脏等脏器,称重,计算脏体比,以观察Aβ片段及干预物质对大鼠各脏器发育的影响。2.体外实验选用24h龄Wistar大鼠,在无菌条件下取出大脑皮质,并用0.25%胰酶消化,以2×10~5密度接种神经细胞,在培养基中加入Aβ多肽片段(Aβ25-35或Aβ31-35)建立细胞损伤模型。实验分为对照组、模型组、染料木黄酮(27μg/ml)单独干预组、叶酸(40μg/ml)单独干预组和二者联合干预组。模型组细胞培养48h后经Aβ31-35(终浓度为25μM)染毒;各干预组在给予Aβ31-35之前2h给予相应的染料木黄酮和/或叶酸,共同孵育24h,收集细胞,进行以下指标的检测。1)通过核荧光染色观察神经细胞的形态学变化;2)通过MTT试验检测细胞活性;3)通过单细胞凝胶电泳技术检测DNA氧化损伤情况;4)通过激光扫描共聚焦显微镜检测神经细胞线粒体膜电位的变化;5)用RT-PCR方法检测神经细胞凋亡相关基因(bax、bcl-2和p53)mRNA表达的情况。结果1.Aβ对大鼠学习记忆功能的影响与对照组相比,模型组大鼠平均逃避潜伏期和总路程均显著延长(p＜0.05)、大脑皮层和海马CA1区淀粉样蛋白阳性细胞数目明显增多(p＜0.01)。2.大豆异黄酮联合叶酸对Aβ致大鼠学习记忆功能损伤的影响与模型组相比,各干预组大鼠平均逃避潜伏期均降低(p＜0.05)、大脑皮层淀粉样蛋白沉积阳性细胞数目明显减少(p＜0.05)。3.Aβ对神经细胞的氧化损伤和凋亡作用核荧光染色分析可见:对照组细胞的染色质均匀分散于细胞核内,而模型组可见部分细胞的染色质出现典型细胞凋亡样改变,表现为染色质呈月牙形聚集于核的一极,染色质皱缩、浓缩、断裂、形成凋亡小体;与对照组相比,模型组细胞的活性降低(p＜0.01)、彗星细胞的拖尾率和尾长增高(p＜0.01)、线粒体的膜电位降低(p＜0.01);与对照组相比,模型组细胞的bcl-2基因表达下调、bax和p53基因表达均上调(p＜0.05)。4.染料木黄酮联合叶酸对Aβ致神经细胞氧化损伤和凋亡作用对影响与模型组比较,各干预组染色质出现凋亡样改变的细胞明显减少,各干预组的细胞活性均有所升高(p＜0.01)、彗星细胞的托尾率和尾长均降低(p＜0.01)、线粒体的膜电位升高(p＜0.01)以及bcl-2基因表达上调、bax和p53基因表达均下调(p＜0.05)。结论本研究以Aβ片段作为诱导大鼠学习记忆功能损伤和体外神经细胞氧化损伤的神经毒,研究大豆异黄酮联合叶酸对Aβ片段引起的神经细胞损伤的保护作用和机制。结果显示:1)Aβ是有效的神经毒性物质,可引起大鼠的学习记忆功能减退和脑组织淀粉样蛋白的表达增加;2)Aβ可引起体外培养的神经细胞氧化损伤和细胞凋亡;2)大豆异黄酮与叶酸单独或联合作用均可拮抗的Aβ神经毒性,从而发挥二者协调的神经保护作用。可能机制为:大豆异黄酮联合叶酸可通过改善机体氧化还原状态,提高机体抗氧化水平;此外,大豆异黄酮联合叶酸还可上调凋亡抑制基因表达和下调凋亡促进基因表达,从而发挥其神经保护作用,减少淀粉样蛋白在大脑的表达,改善大鼠的学习记忆功能。