牙齿作为颅颌面的重要组成部分,主要承担咀嚼功能,同时在保持脸部外形及面容美观、帮助发音等方面也发挥重要作用。牙齿发育依赖于外胚层来源的牙上皮和颅神经嵴来源的间充质之间的相互作用。其中,上皮或间充质组分须有一者具备诱导成牙潜能。在将来,想要利用基于干细胞的组织工程实现人类牙齿再生也应当遵循体内牙齿发育的原则,需要上皮与间充质源性的干细胞,同时需要其中之一具备诱导成牙潜能。目前为止,无论是牙源性间充质干细胞还是牙源性上皮细胞的替代物,均不具备诱导成牙潜能,仅能被动地响应发育诱导信号而分化形成牙齿组织。因此,鉴定诱导成牙潜能的分子构成,赋予这些细胞具备诱导成牙潜能,是牙齿再生工程中的一项重大挑战,也是极为关键的一步。考虑到通过鉴定牙间充质诱导成牙潜能的分子构成去赋予牙源性间充质干细胞具备诱导成牙能力应该比通过鉴定牙上皮诱导成牙潜能的分子构成去赋予非牙源性上皮细胞具备诱导成牙能力更容易实现,因此我们旨在解析牙间充质诱导成牙潜能的分子构成。在课题组前期研究中,以小鼠为研究模型,我们确立了小鼠E13.5和E14.5磨牙间充质细胞（m MMC）经体外培养具备/丧失诱导成牙潜能的时间节点,通过RNA-Seq技术筛选到m MMC具备诱导成牙潜能的关键因子之一Sfrp5,并证实Sfrp5可有效维持m MMC的诱导成牙潜能。在本研究中,我们首先利用组织重组技术,分别尝试了两种外源添加SFRP5蛋白的研究体系（一种是在m MMC（已丧失诱导成牙潜能）与第二鳃弓上皮进行重组的过程中添加SFRP5蛋白琼脂珠;另一种是在m MMC（已丧失诱导成牙潜能）体外培养过程中添加外源SFRP5蛋白共培养一定时间后,细胞重聚并与第二鳃弓上皮进行重组）,探究SFRP5是否能够使丧失诱导成牙潜能的m MMC重新具备该潜能,同时检测了这两种研究体系中成牙关键基因的表达变化。结果表明,外源添加SFRP5蛋白能够在m MMC完全丧失诱导成牙潜能后,有效提高m MMC成牙关键基因的表达水平,从而挽救m MMC的诱导成牙潜能,使其重新具备诱导成牙能力。但SFRP5蛋白的挽救能力随m MMC体外培养时间的延长而下降,同时相比于在体外培养过程中添加SFRP5蛋白共培养,在体外重组时添加SFRP5蛋白对m MMC诱导成牙潜能的挽救效果更佳。因此,我们认为Sfrp5是m MMC具备诱导成牙潜能的关键因子之一。尽管Sfrp5对牙间充质诱导成牙潜能的调控可能与多个信号通路相关,但前期研究发现,Sfrp5可以有效维持m MMC中β-catenin的表达,在m MMC中作为激活因子促进Wnt/β-catenin信号通路传导。因此,我们进一步在m MMC中深入研究Sfrp5在Wnt/β-catenin信号通路中的作用机制。结果发现,m MMC经体外培养8h后,在体外重组时添加外源SFRP5蛋白仍能显著地提高重组体中Wnt/β-catenin信号通路的活性,而在体外培养时添加外源SFRP5蛋白共培养的m MMC中Wnt/β-catenin信号通路活性也能在一定程度上被提高（尽管Wnt/β-catenin信号通路活性水平总体较低）,此结果与重组成牙率相吻合。说明Sfrp5对m MMC中的Wnt/β-catenin信号通路具有激活作用,而不是拮抗作用,与课题组前期的研究结果相吻合。为探究Sfrp5对Wnt/β-catenin信号通路的调控机制,我们检测了牙齿发育过程中内源Sfrp5和β-catenin的表达模式,发现内源性SFRP5和β-catenin的表达位置存在重叠。进一步分析了外源SFRP5蛋白对m MMC中SFRP5与β-catenin共定位表达情况,发现m MMC体外培养8h后,尽管SFRP5与β-catenin的表达在时间与空间上均有一定程度的重合,但二者在细胞质和细胞核中的表达都十分微弱,而外源SFRP5蛋白能够有效提高m MMC细胞质和细胞核中的SFRP5和β-catenin含量,同时SFRP5与β-catenin在m MMC的细胞质和细胞核中的共定位重合程度也显著提高。进一步利用蛋白邻位连接技术检测发现,在牙齿发育过程中,内源性SFRP5与β-catenin在时间与空间上存在不同程度的相互作用。结果说明,m MMC具备诱导成牙潜能与其细胞内SFRP5与β-catenin的水平密切相关,二者可能通过互作来提高Wnt/β-catenin信号活性,使Wnt活性维持在一定水平。最后,为鉴定Sfrp5调控的下游关键因子,收集经SFRP5蛋白（实验组）或BSA（对照组）共培养5h的m MMC样品进行转录组测序分析,对Sfrp5调控的下游关键基因进行筛选,得到了51个显著差异表达基因。GO富集分析结果显示,大多数的基因涉及酪氨酸的修饰及磷酸化,以及酪氨酸的磷酸化频率、速率或程度的调节,还有一部分涉及表皮生长因子受体（EGFR）信号通路和ERBB信号通路。通过查阅基因功能,发现显著下调的基因中很多都是与促进细胞凋亡相关,而上调的基因中大多为细胞外基质组份与核内作用的转录因子。结合GO富集分析和基因功能的结果,筛选了2个最有可能是Sfrp5调控的下游关键基因:Pik3r2和Sstr2。已有文献表明,Pik3r2通过编码PI3K的调节亚基,促进PI3K通路的激活;Sstr2不仅与酪氨酸磷酸激酶活性有关,还能抑制PI3K介导的信号通路活性,而PI3K信号通路涉及的多个下游反应均与β-catenin的磷酸化状态、向细胞核转移以及稳定性相关。因此,我们推测,在m MMC中,Pik3r2和Sstr2可能与促进β-catenin向细胞核转移,促进与其他转录因子相互作用,维持β-catenin的稳定性和定位等过程密切相关。本研究有助于进一步解析牙间充质诱导成牙潜能的分子构成,理解m MMC中Sfrp5对Wnt/β-catenin信号通路的作用机理,为实现人类牙齿再生奠定重要的理论基础。