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随着全球气温不断升高，黄淮海中南部地区高温热害频发，造成了玉米的严重减产与品质下降，这成为生产上亟待解决的突出问题。因此，面对高温对玉米生产带来的严峻考验，深入解析玉米耐高温生理生化与分子机制，尤其是重要调控基因的作用机制，将对玉米缓解热害技术的研究及耐高温新品种的选育至关重要。腺苷酸环化酶(AC，Adenylyly cyclase)催化ATP生成3，5-环腺苷酸(cAMP)。在植物中，虽然cAMP已被证实为重要的多功能信号分子且参与植物对高温胁迫的响应，但目前哪种AC对高温胁迫存在响应及其催化产生的cAMP在植物耐高温胁迫中的作用机制并不清楚。对此进行研究，将有助于揭示ACs-cAMP信号级联在植物耐高温胁迫中的作用。因此，本论文利用iTRAQ定量蛋白质组学等技术筛选对高温胁迫存在响应的玉米AC并鉴定其催化产生的cAMP在玉米耐高温胁迫中的作用机制，这不仅仅为揭示cAMP在提高玉米耐热性中的机制奠定理论基础，进而为选育抗逆玉米新品种提供优异的基因资源。主要的研究结果如下:
(1)cAMP可减轻由高温胁迫引起的氧化损伤。为证明cAMP在玉米耐高温胁迫中的作用，膜渗透cAMP类似物10μm8-Br-cAMP与20μmAC抑制剂2，5-二脱氧腺苷(2，5-dideoxyadenosine，DDA)被用。结果显示，与对照组相比，8-Br-cAMP预处理显著抑制了由高温胁迫引起的玉米叶片和根中H2O2、MDA含量的增加，但却促进高温胁迫诱导的玉米叶片和根中的SOD和APX的活性的增加，而AC抑制剂预(DDA)处理的结果正好与此相反。此外，cAMP处理的玉米植株在高温胁迫7天后的成活率(86％)是对照组的(17％)5倍。这些结果显示cAMP预处理可能通过诱导玉米植株中的抗氧化防护酶活性来清除体内过量生成的过氧化物，从而维持脂膜的稳定性并提高玉米的耐热性，也显示ACs-cAMP信号级联可能在植物耐高温胁迫中起着积极的作用。
(2)高温胁迫下cAMP调控的差异蛋白的鉴定。为鉴定对高温胁迫存在响应的AC及确定cAMP对高温胁迫下玉米蛋白质组的影响，对玉米植株进行8-Br-cAMP或DDA预处理后再进行高温胁迫，然后提取叶片蛋白并利用iTRAQ定量蛋白质组学技术进行分析。结果显示高温胁迫下310个与cAMP相关的差异表达蛋白(DEP)被鉴定。通过KEGGpathway分析表明，这些DEPs主要参与代谢、次级代谢的生物合成、内质网的蛋白加工、氧化磷酸化、核糖体、光合作用、泛素介导的蛋白降解、植物与真菌的互作等信号通路。这显示cAMP参与植物的多种生理活动，暗示其在植物适应胁迫中的重要性。此外，一个推测的类疾病抵抗蛋白ZmRPP13-LK3表达在高温胁迫下显著增加了7倍且被cAMP预处理进一步促进。由于玉米中已知的腺苷酸环化酶ZmPSiP也属于疾病抵抗蛋白，所以我们推测ZmRPP13-LK3可能是一个新的AC。
(3)玉米腺苷酸环化酶ZmRPP13-LK3酶活性的鉴定。为证明ZmRPP13-LK3是一个新的AC，对ZmRPP13-LK3与植物中已鉴定的7个ACs的保守催化活性中心序列进行等比对，发现其有3个保守的AC催化中心。进一步设计3个实验来证明ZmRPP13-LK3是一个AC:1)在缺失AC的大肠杆菌cycA突变菌株中过表达ZmRPP13-LK3的重组质粒，发现ZmRPP13-LK3回补cycA突变菌株的表型与野生型一致;2)在玉米原生质体瞬时沉默体系抑制ZmRPP13-LK3表达、在HEK293细胞培养体系过表达ZmRPP13-LK3后，发现cAMP的含量分别显著降低与升高;3)将在HEK293细胞诱导表达并纯化出的ZmRPP13-LK3加入到含有底物的反应体系中，发现反应体系内有cAMP的生成并其在30min时生成的cAMP的量达到最大值。总之，上述试验证明ZmRPP13-LK3是玉米中一个新的AC，这为揭示ACs-cAMP信号级联在植物耐高温胁迫中的作用提供了可能。
(4)ABA增加了高温胁迫下cAMP含量和ZmRPP13-LK3的表达量。本研究发现，高温胁迫显著增加玉米叶中的ABA含量。为确定高温胁迫下ABA对ZmRPP13-LK3表达的影响，ABA缺失突变体vp5及其野生型Vp5被用。结果显示，高温胁迫下ZmRPP13-LK3表达与cAMP含量的增加均明显少于其野生型Vp5，且高温胁迫、外源施加ABA均能诱导玉米叶片中ZmRPP13-LK3的表达，而外源施加ABA合成抑制剂钨酸盐(Tu)则降低高温诱导的ZmRPP13-LK3的表达。此外，为进一步证明高温胁迫、ABA对ZmRPP13-LK3表达的调控作用，高温胁迫、ABA对ZmRPP13-LK3启动子活性的影响被分析。结果显示ZmRPP13-LK3的启动子活性受到高温、ABA的诱导。
(5)ZmRPP13-LK3定位于线粒体，并与ZmABC2相互作用。为更好地揭示ZmRPP13-LK3在玉米耐高温胁迫中的作用，对ZmRPP13-LK3亚细胞位点及其互作蛋白进行分析。Confocal结果显示ZmRPP13-LK3定位于线粒体;酵母双杂交、BiFC等技术证明ZmRPP13-LK3与ABC转运蛋白ZmABC2存在相互作用，暗示ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP可能通过ZmABC2运出线粒体，由此调控线粒体到核的反向调节信号通路。
(6)ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP参与了ABA调控的玉米耐热性。为进一步确定ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP在玉米耐热性中的作用，利用玉米原生质体瞬时表达系统抑制ZmRPP13-LK3后，发现高温诱导的sHSP1Z2、sHSP1Z4、HSP70和HSP82表达量均显著被降低。此外，8-Br-cAMP预处理显著促进高温胁迫诱导的ABA信号通路中的与耐热性相关基因WRKY106、RD29B和ABA1的表达。这些结果表明ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP可能参与ABA调控的玉米的耐热性。
(7)cAMP介导的玉米根系的耐热性。为确定cAMP对高温胁迫下玉米根的影响，对玉米植株进行8-Br-cAMP或DDA预处理后再进行高温胁迫，然后提取根系蛋白并利用iTRAQ定量蛋白质组学技术进行分析。结果分析显示高温胁迫下268个与cAMP相关的DEPs被鉴定，其中包括ZmRPP13-LK3。通过KEGGpathway分析表明，这些DEPs参与玉米根中许多重要的生物过程，包括离子吸收、自噬或泛素蛋白酶体系统降解蛋白质、通过囊泡运输快速转运应激相关的货物分子以及防御蛋白的适应反应。此外，cAMP预处理提高了高温胁迫下根系对ca2+、PO43-和NO3-的吸收，但降低K+的吸收，而不影响Mg2+的吸收。上述结果有助于我们理解cAMP信号在提高玉米根系的耐热性的作用机制。
综上所述，本研究证明ZmRPP13-LK3是一个新的位于玉米线粒体的AC，其对高温胁迫存在响应，且其催化产生的cAMP作为ABA下游信号分子，调控与耐热性相关基因如HSPs、WRKY106、RD29B和ABA1的表达及根系对矿质营养的吸收。这些研究结果不仅促进人们对ZmRPP13-LK3-cAMP信号通路在植物耐高温胁迫中的作用机制的理解，而且可为促进cAMP作为提高作物耐热性化学调控剂的推广应用奠定基础，并为玉米育种提供优异基因资源。
(1)cAMP可减轻由高温胁迫引起的氧化损伤。为证明cAMP在玉米耐高温胁迫中的作用，膜渗透cAMP类似物10μm8-Br-cAMP与20μmAC抑制剂2，5-二脱氧腺苷(2，5-dideoxyadenosine，DDA)被用。结果显示，与对照组相比，8-Br-cAMP预处理显著抑制了由高温胁迫引起的玉米叶片和根中H2O2、MDA含量的增加，但却促进高温胁迫诱导的玉米叶片和根中的SOD和APX的活性的增加，而AC抑制剂预(DDA)处理的结果正好与此相反。此外，cAMP处理的玉米植株在高温胁迫7天后的成活率(86％)是对照组的(17％)5倍。这些结果显示cAMP预处理可能通过诱导玉米植株中的抗氧化防护酶活性来清除体内过量生成的过氧化物，从而维持脂膜的稳定性并提高玉米的耐热性，也显示ACs-cAMP信号级联可能在植物耐高温胁迫中起着积极的作用。
(2)高温胁迫下cAMP调控的差异蛋白的鉴定。为鉴定对高温胁迫存在响应的AC及确定cAMP对高温胁迫下玉米蛋白质组的影响，对玉米植株进行8-Br-cAMP或DDA预处理后再进行高温胁迫，然后提取叶片蛋白并利用iTRAQ定量蛋白质组学技术进行分析。结果显示高温胁迫下310个与cAMP相关的差异表达蛋白(DEP)被鉴定。通过KEGGpathway分析表明，这些DEPs主要参与代谢、次级代谢的生物合成、内质网的蛋白加工、氧化磷酸化、核糖体、光合作用、泛素介导的蛋白降解、植物与真菌的互作等信号通路。这显示cAMP参与植物的多种生理活动，暗示其在植物适应胁迫中的重要性。此外，一个推测的类疾病抵抗蛋白ZmRPP13-LK3表达在高温胁迫下显著增加了7倍且被cAMP预处理进一步促进。由于玉米中已知的腺苷酸环化酶ZmPSiP也属于疾病抵抗蛋白，所以我们推测ZmRPP13-LK3可能是一个新的AC。
(3)玉米腺苷酸环化酶ZmRPP13-LK3酶活性的鉴定。为证明ZmRPP13-LK3是一个新的AC，对ZmRPP13-LK3与植物中已鉴定的7个ACs的保守催化活性中心序列进行等比对，发现其有3个保守的AC催化中心。进一步设计3个实验来证明ZmRPP13-LK3是一个AC:1)在缺失AC的大肠杆菌cycA突变菌株中过表达ZmRPP13-LK3的重组质粒，发现ZmRPP13-LK3回补cycA突变菌株的表型与野生型一致;2)在玉米原生质体瞬时沉默体系抑制ZmRPP13-LK3表达、在HEK293细胞培养体系过表达ZmRPP13-LK3后，发现cAMP的含量分别显著降低与升高;3)将在HEK293细胞诱导表达并纯化出的ZmRPP13-LK3加入到含有底物的反应体系中，发现反应体系内有cAMP的生成并其在30min时生成的cAMP的量达到最大值。总之，上述试验证明ZmRPP13-LK3是玉米中一个新的AC，这为揭示ACs-cAMP信号级联在植物耐高温胁迫中的作用提供了可能。
(4)ABA增加了高温胁迫下cAMP含量和ZmRPP13-LK3的表达量。本研究发现，高温胁迫显著增加玉米叶中的ABA含量。为确定高温胁迫下ABA对ZmRPP13-LK3表达的影响，ABA缺失突变体vp5及其野生型Vp5被用。结果显示，高温胁迫下ZmRPP13-LK3表达与cAMP含量的增加均明显少于其野生型Vp5，且高温胁迫、外源施加ABA均能诱导玉米叶片中ZmRPP13-LK3的表达，而外源施加ABA合成抑制剂钨酸盐(Tu)则降低高温诱导的ZmRPP13-LK3的表达。此外，为进一步证明高温胁迫、ABA对ZmRPP13-LK3表达的调控作用，高温胁迫、ABA对ZmRPP13-LK3启动子活性的影响被分析。结果显示ZmRPP13-LK3的启动子活性受到高温、ABA的诱导。
(5)ZmRPP13-LK3定位于线粒体，并与ZmABC2相互作用。为更好地揭示ZmRPP13-LK3在玉米耐高温胁迫中的作用，对ZmRPP13-LK3亚细胞位点及其互作蛋白进行分析。Confocal结果显示ZmRPP13-LK3定位于线粒体;酵母双杂交、BiFC等技术证明ZmRPP13-LK3与ABC转运蛋白ZmABC2存在相互作用，暗示ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP可能通过ZmABC2运出线粒体，由此调控线粒体到核的反向调节信号通路。
(6)ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP参与了ABA调控的玉米耐热性。为进一步确定ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP在玉米耐热性中的作用，利用玉米原生质体瞬时表达系统抑制ZmRPP13-LK3后，发现高温诱导的sHSP1Z2、sHSP1Z4、HSP70和HSP82表达量均显著被降低。此外，8-Br-cAMP预处理显著促进高温胁迫诱导的ABA信号通路中的与耐热性相关基因WRKY106、RD29B和ABA1的表达。这些结果表明ZmRPP13-LK3催化产生的cAMP可能参与ABA调控的玉米的耐热性。
(7)cAMP介导的玉米根系的耐热性。为确定cAMP对高温胁迫下玉米根的影响，对玉米植株进行8-Br-cAMP或DDA预处理后再进行高温胁迫，然后提取根系蛋白并利用iTRAQ定量蛋白质组学技术进行分析。结果分析显示高温胁迫下268个与cAMP相关的DEPs被鉴定，其中包括ZmRPP13-LK3。通过KEGGpathway分析表明，这些DEPs参与玉米根中许多重要的生物过程，包括离子吸收、自噬或泛素蛋白酶体系统降解蛋白质、通过囊泡运输快速转运应激相关的货物分子以及防御蛋白的适应反应。此外，cAMP预处理提高了高温胁迫下根系对ca2+、PO43-和NO3-的吸收，但降低K+的吸收，而不影响Mg2+的吸收。上述结果有助于我们理解cAMP信号在提高玉米根系的耐热性的作用机制。
综上所述，本研究证明ZmRPP13-LK3是一个新的位于玉米线粒体的AC，其对高温胁迫存在响应，且其催化产生的cAMP作为ABA下游信号分子，调控与耐热性相关基因如HSPs、WRKY106、RD29B和ABA1的表达及根系对矿质营养的吸收。这些研究结果不仅促进人们对ZmRPP13-LK3-cAMP信号通路在植物耐高温胁迫中的作用机制的理解，而且可为促进cAMP作为提高作物耐热性化学调控剂的推广应用奠定基础，并为玉米育种提供优异基因资源。