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目的在本课题组前期研究荷叶碱干预非酒精脂肪性肝炎的实验基础上,通过细胞体外和动物体内实验模型,探讨脂肪性肝损伤模型发生、发展的特点,同时进一步明确荷叶碱对非酒精性脂肪性肝损伤的干预作用,深入探讨其可能的作用机制。方法1、建立FFA诱导Hep G2细胞形成脂肪性肝损伤模型,通过CV法和MTT比色法检测细胞活力,油红O染色观察细胞模型中脂质浸润的情况,Seahorse XF96检测线粒体的呼吸功能,高内涵成像定量分析系统检测线粒体膜电位的变化和细胞内总活性氧的相对荧光强度,RT-PCR测定脂质转运分子和炎症因子的基因表达,进一步观察肝损伤细胞模型的特点。2、初步通过CV法检测不同浓度的荷叶碱对Hep G2细胞的毒性作用,并采用RTCA实时连续监测荷叶碱干预Hep G2脂肪性细胞损伤模型的细胞存活率。采用油红O染色观察模型细胞中脂质的浸润情况,RT-PCR法检测脂质调节相关分子的基因表达,Seahorse XF96检测细胞内线粒体的能量代谢水平,高内涵成像定量分析系统检测检测线粒体膜电位的变化和细胞内总活性氧的相对荧光强度,RT-PCR法和ELISA法检测IL-6和IL-8炎性细胞因子的基因表达和分泌表达,深入研究荷叶碱对脂肪性细胞损伤模型的脂质浸润的影响、线粒体呼吸功能的影响、氧化应激和炎症反应的影响,明确荷叶碱的保护作用。3、进一步通过流式细胞技术分析荷叶碱对Hep G2脂肪性细胞损伤模型内细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测细胞内细胞色素c、BCL-2家族和Caspase家族等凋亡相关分子的基因表达,并通过Western-Blot法检测细胞内的BAX和BCL-2蛋白表达的变化,探讨荷叶碱对Hep G2脂肪性细胞损伤模型凋亡的作用。4、复制MCD饮食诱导C57BL/6小鼠形成脂肪性肝损伤小鼠模型,并通过灌胃不同剂量的荷叶碱对模型进行干预治疗。采用NAS评分标准对肝组织病理形态学HE染色和油红O染色结果进行病理学改变的观察,检测血清中酶活力水平、血脂水平和肝组织中肝脂水平等生化学指标,确定荷叶碱对非酒精性脂肪性肝损伤小鼠模型的干预作用。进一步通过免疫组化法对凋亡细胞进行标记,探讨荷叶碱对肝损伤小鼠模型的肝细胞凋亡的影响。结果1、体外细胞实验显示:不同浓度的游离脂肪酸在不同程度均抑制了Hep G2细胞的存活率（p＜0.001）,且CV法和MMT比色法检测细胞的存活率具有差异（p＜0.05）。其中,0.5m M游离脂肪酸对Hep G2的细胞存活率为51.57±3.65%,可诱导并形成体外脂肪性细胞肝损伤模型。在脂肪性细胞损伤模型内,脂质积聚且脂质转运分子FATP2（p＜0.001）和FATP5（p＜0.01）的基因表达显著降低;且脂肪性细胞损伤模型内线粒体的能量代谢水平明显下降,线粒体膜电位由高向低发生去极化（p＜0.01）;同时,脂肪性细胞损伤模型细胞内的总活性氧水平也显著增加（p＜0.01）,模型细胞内TNF-α（p＜0.01）、IL-1β（p＜0.001）、IL-6（p＜0.001）和IL-8（p＜0.01）炎症因子的基因表达均显著升高。2、不同浓度的荷叶碱对Hep G2细胞的细胞存活率均小于CC95范围,且自24h起,40μM（p＜0.01）、20μM（p＜0.001）和10μM（p＜0.001）的荷叶碱均能显著提高脂肪性细胞损伤模型的细胞存活率。在体外脂肪性细胞损伤模型中,10μM的荷叶碱能改善脂肪性细胞损伤模型内的脂质浸润情况,且不同浓度的荷叶碱能一定程度提高模型内脂质转运分子的基因表达（p＜0.05）。同时,不同浓度的荷叶碱能调节脂肪性细胞损伤模型内线粒体的能量代谢水平和线粒体膜电位的去极化情况。荷叶碱还能降低脂肪性细胞损伤模型内总ROS水平,其中10μM具有显著性差异（p＜0.05）,且有效地降低细胞内IL-6和IL-8炎性因子的基因表达（p＜0.01）和分泌表达（p＜0.05）。3、在细胞水平上,荷叶碱对脂肪性细胞损伤模型的凋亡表现出下调作用;在转录水平上,荷叶碱对脂肪性细胞损伤模型内CYCs（p＜0.05）、BCL-2家族（p＜0.001）以及Caspase家族（p＜0.05）凋亡相关分子的基因表达体现出一定的调节作用;在蛋白水平上,荷叶碱能一定程度抑制脂肪性细胞损伤模型内BAX蛋白的表达,以及促进模型内BCL-2蛋白的表达。通过计算BAX/BCL-2,荷叶碱均显著降低了脂肪性细胞损伤模型的相对m RNA表达比值（p＜0.01）和相对蛋白表达比值（p＜0.01）。4、体内动物实验显示:荷叶碱能一定程度上改善MCD饮食诱导的肝损伤小鼠模型内肝组织脂肪变性和气球样变程度,且40mg/kg的荷叶碱干预组具有差异性（p＜0.05）。同时,荷叶碱能改善MCD饮食诱导的肝损伤小鼠模型肝功能水平,即降低血清的ALT（p＜0.05）和AST（p＜0.05）酶活力;并能显著降低肝损伤小鼠模型中血清的TG（p＜0.01）和LDL（p＜0.001）水平;同时肝脏的TG和TC水平也有一定程度地下降,40mg/kg的荷叶碱干预组具有差异性（p＜0.01）。此外,荷叶碱还能一定程度地缓解肝损伤小鼠模型肝组织内的细胞凋亡情况（p＜0.05）。结论1、荷叶碱能在一定程度上改善MCD饮食诱导的肝损伤小鼠模型脂肪性肝损伤的形成和发展。2、在游离脂肪酸诱导的Hep G2脂肪性细胞损伤模型中,荷叶碱具有一定的抗炎和抗氧化应激作用,可以调节脂质的浸润情况、促进线粒体呼吸功能、抑制细胞凋亡来干预肝损伤的形成和发展。3、荷叶碱可能是通过抑制线粒体介导的细胞凋亡途径,从而实现其干预非酒精性脂肪性肝损伤形成和发展的作用。