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目的:利用体内外帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型探讨伴侣蛋白L-异天冬氨酸甲基转移酶(Protein L-isoaspartate-methyltransferase,PIMT)功能异常对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)神经毒性的影响及羟基积雪草苷(Madecassoside,MA)的保护作用;进一步确认内质网应激、自噬失衡和micro RNAs(miRNAs)表达紊乱在其中的作用机制;寻找MA防治PD的分子靶标。方法:(一)体内实验采用MPTP亚急性建立PD小鼠模型。MPTP及MA处理9月龄的野生型(Wild-type,WT)PIMT杂合(Heterozygous,HZ)小鼠。神经毒性药物MPTP(27mg/kg)腹腔注射构建帕金森病小鼠模型,连续5天,最后一次MPTP注射后8h腹腔注射MA(2mg/kg),隔天注射一次,持续14天。将小鼠分为以下8组:○1 WT+Saline group;○2 WT+MPTP group;○3 WT+MA group;○4 WT+MPTP+MA group;○5 HZ+Saline group;○6 HZ+MPTP group;○7 HZ+MA group;○8HZ+MPTP+MA。利用以上各组小鼠,然后完成以下实验:(1)行为学实验(步态试验和滚轮试验)评估MA的神经保护作用;(2)免疫荧光检测各组小鼠纹状体中α-synuclein的积聚;(3)Western Blot检测各组小鼠纹状体中TH的表达;(4)Western Blot检测各组小鼠纹状体中UPR通路相关分子IRE1α,p-IRE1α和Bip的表达;(5)实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测各组小鼠纹状体中自噬相关分子p62和Beclin-1的表达;(6)RT-q PCR检测各组小鼠纹状体中miRNAs表达。(二)体外实验使用MPTP的毒性代谢物MPP+建立PD细胞模型,在慢病毒sh RNA干扰PIMT表达和pc DNA3.1过表达PIMT的SH-SY5Y细胞中使用MPP+和MA处理,获得以下12组细胞:○1 sh RNA/pc DNA3.1-NC+vehicle;○2 sh RNA/pc DNA3.1-NC+MPP+;○3 sh RNA/pc DNA3.1-NC+MA;○4 sh RNA/pc DNA3.1-NC+MPP++MA;○5 sh RNA-PIMT+vehicle;○6 sh RNA-PIMT+MPP+;○7 sh RNA-PIMT+MA;○8sh RNA-PIMT+MPP++MA;○9 pc DNA3.1-PIMT+vehicle;○10 pc DNA3.1-PIMT+MPP+;○11 pc DNA3.1-PIMT+MA;○12 pc DNA3.1-PIMT+MPP++MA。完成以下实验:(1)CCK-8检测各组细胞活性;(2)Western blot检测各组细胞中PIMT表达;(3)免疫荧光检测各组细胞中α-synuclein、PIMT、LC3和p62表达;(4)DCFH-DA荧光探针检测各组细胞中ROS的生成;(5)Western Blot检测各组细胞中IRE1α,p-IRE1α和Bip的表达;(6)RT-q PCR检测PIMT各组细胞miRNAs表达;结果:(一)体内实验(1)MA改善PD小鼠的运动障碍:a.步态试验中MPTP减弱小鼠四肢力量和运动能力,MA有改善作用。b.滚轮试验中MPTP降低小鼠平衡能力,MA有恢复作用。(2)PIMT缺失加剧MPTP对α-synuclein积聚的影响,MA具有改善作用。(3)PIMT缺失加剧MPTP对TH表达的影响,MA具有改善作用。(4)Western blot实验结果显示MPTP升高IRE1α和p-IRE1α表达,PIMT缺失加剧IRE1α和p-IRE1α表达升高,MA有保护作用。(5)RT-q PCR结果显示MPTP降低自噬相关分子p62和Beclin-1表达,MA有保护作用。(6)RT-q PCR结果显示PIMT缺失加剧MPTP对miR-34a-5p和miR-181c-3p表达的影响,MA有保护作用。(二)体外实验(1)细胞活性检测结果显示MPP+降低SH-SY5Y细胞活性;干扰PIMT表达加剧MPP+对细胞活性的影响,而过表达PIMT抑制MPP+对细胞活性的影响,MA有保护作用。(2)MA改善PD模型中PIMT的降低:a.Western blot实验结果显示MPP+降低PIMT表达,MA有保护作用。b.免疫荧光实验结果显示MPP+降低PIMT表达,MA有保护作用。(3)免疫荧光实验结果显示PIMT和α-synuclein呈现共定位的表达模式;MPP+引起α-synuclein积聚;干扰PIMT表达加剧α-synuclein积聚,而PIMT过表达抑制α-synuclein积聚。MA对MPP+和PIMT缺失引起的α-synuclein积聚具有改善作用。(4)Western blot结果显示MPP+升高SH-SY5Y细胞中IRE1α表达,MA有保护作用。(5)免疫荧光结果显示MPP+降低LC3和p62表达;干扰PIMT表达加剧LC3和p62表达水平的降低,而过表达PIMT抑制LC3和p62的降低。MA对MPP+和PIMT缺失引起的自噬失衡具有保护作用。(6)ROS检测结果显示MPP+升高SH-SY5Y细胞中的ROS生成;干扰PIMT表达加剧ROS的产生,而过表达PIMT抑制ROS的产生;MA抑制MPP+和PIMT缺失引起的ROS产生,即抑制氧化应激。(7)RT-q PCR结果显示MPP+升高SH-SY5Y细胞中miR-34a-5p和miR-181c-3p表达,MA能够改善这些miRNAs的表达。结论:(1)在MPTP和MPP+建立的体内外PD模型中,MA改善α-synuclein的异常积聚。(2)MA改善PD模型中PIMT的表达水平。(3)PIMT缺失加剧MPTP/MPP+引起的α-synuclein积聚、氧化应激、内质网应激、自噬失衡和miRNAs表达紊乱;而PIMT过表达能够改善上述PD病理改变,这提示在PD中PIMT功能紊乱在α-synuclein的神经毒性中起到关键作用,同时PIMT功能异常的实验模型可作为研究PD的工具。(4)MA可能通过调节α-synuclein积聚、ROS的产生、内质网应激中的UPR、自噬相关蛋白、miRNAs和PIMT的表达抑制α-synuclein的神经毒性。