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超抗原是一种具有强大免疫刺激功能的新型蛋白质抗原。业已证明，超抗原参与多种疾病的发病过程。对超抗原免疫识别机制的深入研究，可望进一步为相关疾病的防治提供新的方法。金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原家族由于涉及的疾病谱非常广泛，一直是比较活跃的研究领域。目前发现的金葡菌超抗原分子多达十余种。对金葡菌超抗原免疫识别机制研究较多的是SEA、SEB、SEC和TSST-1。已取得的研究进展提示我们，超抗原尽管具有相似的生物学活性，但它们的免疫识别机制存在明显的不同，因此，为了揭示金葡菌超抗原家族免疫识别的全貌，针对该家族其它超抗原分子的进一步研究是十分必要的。 SED是一种常见的毒性作用较强的金葡菌肠毒素，但对其免疫识别的研究相对较少，目前尚无涉及SED与TCR相互作用的研究。已有研究发现SEC3和SEB的TCR结合位位于分子两个结构域之间的沟槽内。将SED与SEB、SEC3的氨基酸序列进行比较分析，发现某些与TCR结合的活性位点比较保守。值得关注的是，这些保守的活性位点是否同样决定了SED的TCRVβ特异性?SED与其它肠毒素超抗原的TCR免疫识别位有何异同? 目前对SED与MHC的结合方式尚不明确。有研究表明，SEA具有两个MHC结合位，氨基末端的结合位与MHCⅡ的α链结合，羧基末端的结合位与MHCⅡ的β链结合，阻止SEA与MHCⅡα链结合可影响SEA对某些TCR V β ~+T细胞的活化。研究发现SED的某些MHC结合位点与SEA一致，那么二者与MHC的结合方式是否也相同?SED与MHCⅡα链亲和力的改变对其TCRVβ特异性有何影响?目前尚未见这方面的研究。 基于以上问题，我们对SED可能的活性位点进行预测，构建了一系列 超抗原SED免疫识别机制的研究SED定点突变体，检测这些突变体的 MHC 11结合活性和 TCRV fi特异性，寻找与TCRV 6结合的关键位点，进一步探讨SED与MHC和TCR的相互作用方式。主要研究内容和结果包括以下几方面： 1．构建SED的原核表达系统，并对蛋白的表达和纯化条件进行优化，用两种系统即人的PBMC和小鼠脾脏细胞，检测了纯化SED的促T淋巴细胞增殖活性和TCRV 6特异性。获得了纯度较高，并具有超抗原活性的SED，为构建SED突变体和后续的功能研究奠定了良好的基础。 2．对金葡菌超抗原家族的氨基酸序列进行对比分析，首次运用同源建模的方法构建了SED的三维空间结构模型，比较SED与其它肠毒素超抗原结构的差异，对可能的活性位点进行预测，最终确定SED的N23、F45、L59、N6、192和 F203位氨基酸为突变位点。 3，以丙氨酸扫描突变方案，采用大引物PCR技术，在选定的突变位点处成功引入预期突变，构建了SEDN23A、SEDF45A、SEDL59A、SEN6lA、SEDI92A和 SEDFZ。3＾突变体。由于随机突变的发生，我们还构建了 SEDN23AIH26R双突变体。并对突变体蛋白进行分析和纯化，获得了可用于后续功能实验的SED突变体。 4．检测了SED突变体促人和小鼠T淋巴细胞的增殖活性，筛选出促增殖活性降低的突变体；进而用竞争结合实验检测突变体与 MHC 11的结合活性，并用流式细胞仪检测突变体TCRV p特异性变化。结果：①证实了F45是胚D与 MHO结合的关键位点，首次发现％D对人 TCRV 6 5”、TCRVp矿、TC RVRV p 12．广和小鼠TC RVRV p 8．U8．3”T细胞的活化增殖能力依赖于N5位点与MHC 11的结合；②首次证明NZ 3位氨基酸是邪D与人TC RV p5和小鼠 TCRV 6 8．2／8．3结合的关键位点；③与 SEDN23A相比，SE民23。6。对人淋巴细胞的促增殖活性明显减低，二者的人TCRV p 5、TCRV p 8、TCRVelZ＊特异性无显著差别，提示 26位氨基酸是 SED与人的其它 TCRV 6结合的关键位点；④与SED相比，突变体SEDLS“、SEDNI小SEDI92＾和SEDFZ仍＾对人和小鼠T淋巴细胞的增殖活性无显著变化，提示这些氨基酸残基可能不是SED的关键活性位点。 Vlll 第三军医大学博士研究生论文 5．结合本研究和其它研究的结果，从以下几个方面进行了探索性研究： ①分析了 SED与 MHC的结合方式，对 SED－MHC的空间结构进行模拟，推 测 SED与 MHC 11的结合方式与 SEA相似，具有两个结合位，分别与 MHC 11a链和p链结合，交联两个MHC分子；②对SED的TCR结合位进行结 构－功能分析，进一步解释我们的研究结果；③通过TCRV p氨基酸序列的 对比分析，发现与同一种超抗原反应的一组TCRV 0具有特征性的保守序 列，这些保守序列很可能与超抗原的TCRV p特异性有关，这一发现为进一 步从TCR的角度探讨超抗原TCRV p特异性的本质提供了重要的线索；④ 最后，对MHCEED－TCR复合物的结构模型进行预测，与MHC－eptide－TCR 的空间结构进行比较，对SED的免疫识别获得了更加全面的认识。 综上，本研究首次对SED与TCR结合的位点进行研究，发现N23和