萝卜(Raphanus sativusL.,2n=2x=18)属十字花科萝卜属,又名芦菔、莱菔,是起源于我国的重要一、二年生根菜类作物。萝卜营养和药用价值较高并且耐贮运性良好,因此在中国乃至全世界范围得到广泛栽培。春季栽培中,萝卜易在低温下通过春化造成先期抽薹,使其品质和产量受到严重影响,给春季萝卜生产和供应造成极大的困扰,因此对萝卜抽薹开花相关基因进行研究显得尤为重要。MADS-box家族在调控抽薹开花和花器官形成过程中起到了重要作用,目前已在许多植物物种中对该家族进行了全基因组鉴定,但是对萝卜MADS-box家族的全基因组鉴定和分析依然欠缺;此外,FLC和miR172作为植物抽薹开花调控网络的重要成员,已在模式作物拟南芥中得到广泛研究,但其在萝卜中的研究大都停留在基因克隆和机制预测方面,尤其对它们在萝卜中生物功能尚未得到有效验证。本研究在萝卜全基因组范围内鉴定了 MADS-box基因家族,分别利用人工miRNA介导的基因沉默和过表达的方式验证了萝卜RsFLC和miR172的生物功能。研究结果有助于更好的理解萝卜MADS-box家族基因结构和功能,为解析萝卜抽薹开花相关基因及miRNA生物功能提供了新思路,同时也为萝卜遗传转化奠定了基础。主要得到以下结果:1.全基因组鉴定了萝卜MADS-box家族基因,一共获得144个萝卜MADS-box家族基因成员。同时,对其余28个植物物种的MADS-box家族基因进行了详细的鉴定和调查。由萝卜和拟南芥之间的系统进化分析可知,144个RsMADS基因可以被分为两大类:68个I型基因(31Ma、12Mp、25Mγ)和76个II型基因(70MIKCC、6MIKC*)。其中,41个RsMADS基因被定位到萝卜9个连锁群上。此外,对萝卜、拟南芥、白菜和水稻四个物种中的MADS-box基因进行了同源分析。萝卜不同组织部位和不同时期叶片的RNA-seq表达谱数据分析表明,该家族基因表达具有明显的时空特异性。实时荧光定量PCR结果表明,部分MIKCC类基因在花器官的不同部位出现明显的差异表达,而另外一些MIKCC类基因在GA、光周期和春化时间处理下也出现了明显的差异表达,这些结果都有力的证明了萝卜MADS-box基因参与并调控了开花和花器官发育过程。2.在前人对萝卜FLC研究基础上,结合拟南芥和萝卜FLC基因序列,在WMD网站上设计出能够特异沉默萝卜FLC基因的21nt amiRFLC,并在拟南芥miR319a前体基础上,通过碱基定位点突变重叠PCR法将miR319/miR319*替换为amiRFLC/amiRFLC*,获得pre-amiRFLC结构。随后,采用双酶切法构建含有amiRFLC过表达载体pCAMBIA2301-pre-amiRFLC,利用瞬时表达的方法将其在萝卜叶片中进行验证,并利用农杆菌介导的浸花法将该重组载体导入拟南芥中。对转基因拟南芥植株分别在基因组水平、转录水平和表型上进行了鉴定。结果表明,pre-amiRFLC基因被成功整合到拟南芥基因组中,并且该基因能成功表达出miRFLC,其靶基因FLC出现显著下调表达,转基因株系表现为明显的早熟早花现象。该研究为萝卜中基因的功能验证提供了新思路和理论指导。3.利用同源克隆法在萝卜基因组序列中分离得到103bpmiR172a前体序列,并利用生物信息方法对其与其他作物的同源性、系统进化及二级结构预测进行分析。同时,参照萝卜基因组序列及本实验室转录组测序得到的unigene序列,分离出miR172a的靶基因RsAP2(1305bp)、RsTOE1(1314bp)和RsTOE3(1077bp)。随后,采用双酶切法构建miR172a过表达载体pCAMBIA2301-pre-miR72a,利用瞬时表达的方法将其在萝卜叶片中进行验证,并利用农杆菌介导的浸花法将该重组载体导入拟南芥中。对转基因拟南芥植株分别在基因组水平、转录水平和表型上进行鉴定。结果表明,萝卜miR172a基因被成功整合到拟南芥基因组中,并且能够成功表达,其靶基因AP2、TOE1和TOE3均出现显著下调表达,转基因株系表现为明显的早熟早花现象,从而在拟南芥中验证了萝卜miR172a具有促进抽薹开花的生物功能。