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研究背景及目的疟疾仍然是一个全球重大公共卫生问题,全球疟疾发病人数已经连续5年呈上升趋势。尽管我国已达到疟疾消除标准,但输入性疟疾仍对我国人民健康构成较大威胁;且我国赴非洲和东南亚等疟疾流行区人数众多,疟疾对此类人群的危害依然非常严重。随着蚊媒对化学杀虫剂抗药性的不断出现和蔓延,利用生物杀虫剂进行蚊媒防治成为了阻断疟疾传播的重要措施。球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus,Bs)是应用最广、使用最成功的生物杀虫剂之一。Bs具有灭蚊选择性强,对非靶生物无毒,在自然界中易降解且不污染环境等优点,同时在某些情况下可以在幼虫尸体中循环利用,目前已成为非洲和其他疟疾流行区蚊媒控制的主要非化学手段。然而在现场使用过程中,球形芽孢杆菌的应用效果会受到诸多生物或非生物因素的影响,如:用量测量不准或生境中植被生长裹住Bs导致幼虫与Bs的接触减少,以及水的p H值、浑浊度和温度等,这些因素可能会降解Bs或改变Bs在蚊体内的活性,造成亚致死剂量效果的产生,导致部分蚊虫存活。存活按蚊在生物杀虫剂的选择压力和球形芽孢杆菌的暴露下,其生理性状可能发生变化。按蚊传播疟疾媒介能力(疟原虫易感性/种群密度)的改变将直接影响疟疾的流行和传播,而亚致死剂量Bs暴露后存活按蚊传疟媒介能力是否会发生改变及其改变机制,目前所知甚少。在本研究中,我们首先利用两种疟原虫感染动物模型,探讨亚致死剂量Bs对存活按蚊的疟原虫易感性影响,其次进一步分析球形芽孢杆菌影响按蚊对疟原虫易感性的天然免疫机制,然后探讨亚致死剂量Bs对存活按蚊繁殖能力的影响,最后分析球形芽孢杆菌通过TOR信号通路影响按蚊繁殖能力的分子机制。本研究将为Bs在实际应用中一旦出现亚致死剂量效应后可能产生的后果预判及制定相应对策提供参考,为Bs的科学合理应用提供指导,也为通过蚊虫防治阻断疟疾传播提供新的思路。研究方法1.亚致死剂量球形芽孢杆菌对存活按蚊的疟原虫易感性影响:(1)利用Probit analysis生物测定方法检测Bs对斯氏按蚊幼虫和大劣按蚊幼虫的杀伤效果;(2)分析Bs浓度与幼虫累积死亡率之间的线性关系以获得处理斯氏按蚊幼虫和大劣按蚊幼虫的亚致死剂量浓度;(3)利用亚致死剂量Bs处理斯氏按蚊和大劣按蚊幼虫后收集存活成蚊并对3 d龄成蚊进行疟原虫攻击感染;24 h后分离饱血雌蚊进行常规饲养;感染后第9天解剖蚊中肠检测卵囊及黑化情况。2.亚致死剂量球形芽孢杆菌影响按蚊对疟原虫易感性的天然免疫机制研究:(1)利用亚致死剂量Bs处理斯氏按蚊和大劣按蚊幼虫后收集存活成蚊并对3 d龄成蚊进行疟原虫攻击感染,24 h后分离饱血雌蚊进行常规饲养;收集按蚊幼虫、蛹、成蚊及疟原虫感染后各时间点的样本;(2)利用实时荧光定量PCR检测亚致死剂量Bs处理对Toll、Imd和JAK-STAT信号通路上关键分子及各信号通路对应抗疟免疫效应分子转录水平的影响;(3)利用RNAi技术沉默按蚊抗疟免疫效应分子并检测亚致死剂量Bs处理后存活按蚊的疟原虫易感性变化情况。3.亚致死剂量球形芽孢杆菌对存活按蚊繁殖能力的影响:(1)利用亚致死剂量Bs处理按蚊幼虫后收集存活成蚊并对3 d龄成蚊进行饲血,24 h后分离饱血雌蚊并进行单只饲养,观察并统计按蚊的产卵情况,饲血后第10天解剖按蚊卵巢并统计滞留蚊卵情况;(2)将上述单只饲养蚊虫产出的子代蚊卵入水,观察孵化率、蛹化率及羽化率的变化情况;(3)利用不同亚致死浓度的Bs处理按蚊幼虫后观察其对繁殖能力的影响;(4)利用亚致死剂量Bs处理按蚊幼虫后收集存活蚊蛹,羽化后分离雌雄按蚊,观察亚致死剂量Bs处理对存活雌蚊、雄蚊及饱血雌蚊生存情况的影响。4.亚致死剂量球形芽孢杆菌通过TOR信号通路影响按蚊繁殖能力的机制研究:(1)在斯氏按蚊的研究中:(1)利用亚致死剂量Bs处理按蚊幼虫后收集存活成蚊并对3 d龄成蚊进行饲血,24 h后分离饱血雌蚊并收集样本进行转录组测序;利用RT-q PCR验证转录组测序结果,筛选并分析出亚致死剂量Bs处理影响按蚊繁殖能力的基因;(2)利用RT-q PCR和Western blot方法检测亚致死剂量Bs处理对存活按蚊Vg基因的转录水平和蛋白水平的影响;利用RNAi技术沉默Vg基因,观察亚致死剂量Bs处理后存活成蚊繁殖能力的变化情况;(3)利用RT-q PCR和Western blot方法检测亚致死剂量Bs处理对存活按蚊TOR信号通路活化水平的影响;利用雷帕霉素抑制TOR,检测亚致死剂量Bs处理对繁殖能力的变化情况;(4)利用BCA方法检测亚致死剂量Bs处理对按蚊中肠血液蛋白浓度的影响;(5)体外培养的Bs菌液混入糖水后直接饲喂成蚊,观察其对按蚊繁殖能力的影响;利用RT-q PCR和Western blot方法检测Bs直接饲喂成蚊对Vg表达和TOR信号通路活化水平的影响;利用雷帕霉素抑制TOR,检测Bs直接饲喂成蚊对繁殖能力的影响;(6)利用BCA方法检测Bs直接饲喂成蚊对中肠血液蛋白浓度的影响;(7)体外培养的Bs菌液的上清液混入糖水后直接饲喂成蚊,观察其对按蚊繁殖能力的影响;利用RT-q PCR和Western blot方法检测Bs上清液直接饲喂成蚊对Vg表达的影响。(2)在大劣按蚊的研究中:(1)利用RACE PCR技术扩增Ad Vg基因的全长c DNA序列;(2)利用RT-q PCR和Western blot检测亚致死剂量Bs处理对存活按蚊Vg表达的影响;(3)原核表达并纯化Vg重组蛋白;利用微量注射回补Vg蛋白,观察其对按蚊产卵能力影响;(4)利用RT-q PCR和Western blot方法检测亚致死剂量Bs处理对存活按蚊TOR信号通路活化水平的影响;(5)体外培养的Bs菌液混入糖水后直接饲喂成蚊,观察其对按蚊产卵能力的影响;利用RT-q PCR和Western blot方法检测Bs直接饲喂成蚊对Vg表达和TOR信号通路活化水平的影响。研究结果1.亚致死剂量球形芽孢杆菌对存活按蚊的疟原虫易感性影响:(1)杀伤斯氏按蚊幼虫的半数致死剂量Bs浓度为16.57 IU/L,杀伤大劣按蚊幼虫的半数致死剂量Bs浓度为5.62IU/L。(2)在斯氏按蚊-约氏疟原虫易感动物模型中,亚致死剂量Bs处理上调了存活按蚊对疟原虫的感染度,感染率无显著性差异;在大劣按蚊-约氏疟原虫不易感动物模型中,亚致死剂量Bs处理下调了存活按蚊对疟原虫的感染率和感染度,导致易感性下降,黑化率和黑化度无统计学差异。2.亚致死剂量球形芽孢杆菌影响按蚊对疟原虫易感性的天然免疫机制研究:(1)在斯氏按蚊的研究中:(1)亚致死剂量Bs处理导致存活斯氏按蚊Toll、Imd和JAK-STAT信号通路上关键分子的转录水平较对照组均受到一定程度抑制。(2)亚致死剂量Bs处理导致存活斯氏按蚊上述三个信号通路的效应分子As DEF1、As TEPs和As NOS基因的转录水平在疟原虫感染后的多个时间点较对照组显著降低。(2)在大劣按蚊的研究中:(1)亚致死剂量Bs处理导致存活大劣按蚊Imd信号通路上关键分子Ad PGRP-LC和Ad Rel2的转录水平显著上调,Toll和JAK-STAT信号通路上的关键分子的转录水平基本无显著性差异。(2)亚致死剂量Bs处理导致存活大劣按蚊抗疟免疫效应分子Ad TEP1的转录水平上调且高水平表达的时间较对照组更长;利用RNAi沉默Ad TEP1基因后,亚致死剂量Bs处理导致存活大劣按蚊对约氏疟原虫易感性降低的现象消失。3.亚致死剂量球形芽孢杆菌对存活按蚊繁殖能力的影响:本课题组前期研究已发现,亚致死剂量Bs处理可导致大劣按蚊产卵能力下降,本研究中仅针对亚致死剂量Bs对斯氏按蚊繁殖能力的影响展开了研究。(1)亚致死剂量Bs处理后存活斯氏按蚊的生卵数(产出蚊卵加滞留蚊体内的蚊卵)、产卵数和产卵率均显著增加,Bs对怀孕率无影响;同时,随着处理幼虫的Bs浓度在一定范围内的增加,存活按蚊的产卵数和生卵数也呈现浓度依赖的增强趋势。(2)亚致死剂量Bs处理后存活斯氏按蚊雌蚊的生存时间较对照组缩短,但吸血后Bs导致雌蚊生存时间缩短的现象消失;亚致死剂量Bs处理对存活斯氏按蚊雄蚊的生存时间无显著性差异。(3)亚致死剂量Bs处理对存活斯氏按蚊子代生命周期发育过程无显著性影响。4.亚致死剂量球形芽孢杆菌通过TOR信号通路影响按蚊繁殖能力的机制研究:(1)在斯氏按蚊的研究中:(1)亚致死剂量Bs处理导致存活斯氏按蚊血餐后As Vg的转录水平和蛋白水平上调;沉默As Vg基因后,亚致死剂量Bs处理增强存活斯氏按蚊繁殖能力的现象消失。(2)亚致死剂量Bs处理导致存活斯氏按蚊TOR信号通路的活化水平上调;利用雷帕霉素抑制TOR信号通路后,亚致死剂量Bs处理上调存活斯氏按蚊As Vg表达增强按蚊繁殖能力的现象消失。(3)亚致死剂量Bs处理对存活斯氏按蚊消化血液蛋白的能力无显著性影响,提示TOR信号通路的活化可能与氨基酸浓度水平无关。(4)Bs直接饲喂斯氏成蚊导致按蚊生卵数增加且产卵能力增强,同时可通过活化TOR信号通路上调As Vg表达增强按蚊的繁殖能力且对按蚊消化血液蛋白的能力无显著性影响,这与亚致死剂量Bs处理后导致存活斯氏按蚊通过活化TOR信号上调As Vg表达增强繁殖能力的现象一致。(5)Bs上清液直接饲喂斯氏按蚊成蚊导致按蚊生卵数增加且产卵能力增强,同时As Vg在血餐后24 h的转录水平和蛋白水平均上调。(2)在大劣按蚊的研究中:(1)首次成功扩增出了Ad Vg基因c DNA的全长序列并表达纯化了大劣按蚊的Vg重组蛋白。(2)亚致死剂量Bs处理导致存活大劣按蚊血餐后Ad Vg的转录水平和蛋白水平显著下调。(3)亚致死剂量Bs处理导致存活大劣按蚊TOR信号通路上的关键分子AKT和TOR的磷酸化水平下调,提示亚致死剂量Bs处理可抑制存活大劣按蚊TOR信号通路下调Ad Vg表达进而抑制按蚊的产卵能力。(4)Bs直接饲喂大劣按蚊成蚊导致产卵能力下降、Ad Vg的转录水平和TOR信号通路活化水平下调,这与亚致死剂量Bs处理导致存活大劣成蚊产卵能力下降的现象一致。研究结论1.亚致死剂量Bs处理对存活斯氏按蚊和大劣按蚊的疟原虫易感性影响不同。在斯氏按蚊-约氏疟原虫易感动物模型中,亚致死剂量Bs处理上调了存活按蚊对疟原虫的易感性;而在大劣按蚊-约氏疟原虫不易感动物模型中,亚致死剂量Bs处理下调了存活按蚊对疟原虫易感性,且黑化反应可能不是导致这一影响的作用机制。2.在斯氏按蚊-约氏疟原虫易感动物模型中,亚致死剂量Bs处理后存活斯氏按蚊可能通过抑制Toll、Imd和JAK-STAT信号通路的活化水平分别下调As DEF1、As TEPs和As NOS的表达降低抗疟免疫效应分子对疟原虫的杀伤,进而导致存活斯氏按蚊对疟原虫的易感性增强;在大劣按蚊-约氏疟原虫不易感动物模型中,亚致死剂量Bs处理后存活大劣按蚊可能通过激活Imd信号通路,上调Ad TEP1的表达增强其对疟原虫的杀伤,进而导致存活大劣按蚊对疟原虫的易感性下降。3.亚致死剂量Bs处理显著增强了存活斯氏雌蚊的繁殖能力;Bs虽可缩短未吸血存活雌蚊的生存时间,但吸血后Bs导致雌蚊生存时间缩短的现象消失。4.在斯氏按蚊中,亚致死剂量Bs处理幼虫后,Bs可能进入存活成蚊体内,通过分泌代谢产物活化TOR信号通路上调As Vg表达进而增强斯氏按蚊的繁殖能力;在大劣按蚊中,亚致死剂量Bs处理幼虫后,Bs可进入存活成蚊体内,通过抑制TOR信号通路下调Ad Vg表达进而抑制按蚊的产卵能力。