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目的微环境低氧是骨质疏松、类风湿性关节炎、原发性骨肿瘤及骨转移癌等溶骨性疾病的共同特征,与疾病进展和不良预后密切相关。低氧诱导因子-1（HIF-1）是调节氧稳态的核心转录因子,由α和β两个亚基组成,HIF-1α为氧调节蛋白,受氧分压的严格调控。常氧条件下,HIF-1α在PHDs作用下羟基化,被p VHL识别后经蛋白泛素化水解系统降解。当细胞处于低氧状态或p VHL功能缺失时,HIF-1α聚积并转运至细胞核内与HIF-1β结合形成HIF-1复合物,作为转录因子与低氧反应元件（HRE）结合,进而激活下游基因的转录,从而引发组织细胞一系列的耐氧适应性反应。HIF-1α在成骨细胞和破骨细胞中均可表达,低氧能够促进破骨细胞分化为多核细胞并增加其骨吸收活性。有研究表明,VEGF和ANGPTL4为HIF-1α下游靶基因,本课题组前期则通过荧光素酶报告基因及Ch IP实验证明IL-6、RANKL亦是HIF-1α新的下游靶基因,共同参与骨形成与骨吸收活性的调节。藏药红景天具有抗缺氧、促血管新生及抗骨质疏松等多种药理作用,课题组前期研究证实,其主要活性成分红景天苷（SAL）可通过上调成骨细胞HIF-1α/VEGF通路介导血管生成骨形成耦联,从而增加去势大鼠骨密度及促进骨折愈合。随后的研究显示:体内实验中SAL可抑制脂多糖（LPS）诱导的小鼠骨量丢失,体外实验中SAL通过上调破骨前体细胞HIF-1α/VEGF、IL-6及ANGPTL4通路促进其分化成熟和骨吸收活性。本文在上述研究基础上,探讨SAL是否经低氧成骨细胞HIF-1α通路即通过旁分泌（成骨-破骨细胞耦联）调控共培养破骨细胞的表型表达。本研究为全面深入阐明SAL抗骨丢失的作用机制奠定基础,为今后临床应用SAL预防和治疗骨丢失提供科学依据。方法1.以小鼠成骨样细胞MC3T3-E1与小鼠原代成骨细胞MOB为实验对象,采用胰酶-胶原酶联合消化法提取MOB,碱性磷酸酶染色法进行鉴定。通过MTT法检测不同浓度SAL（1 n M、10 n M、100 n M、1000 n M、10000 n M）对成骨细胞活力的影响,并确定后续实验药物浓度。通过qRT-PCR、Western blot、ELISA等实验方法,检测SAL对低氧成骨细胞HIF-1α通路中HIF-1α、VEGF、IL-6、ANGPTL4及RANKL基因和蛋白表达的影响。2.以小鼠破骨前体细胞RAW264.7与小鼠骨髓单核巨噬细胞BMMs为实验对象,经RANKL与M-CSF诱导分化为多核破骨细胞,收集成骨细胞培养上清液作为条件培养基与破骨细胞培养基按1:3比例混合作用于破骨细胞,通过MTT和流式细胞术检测破骨细胞活力和凋亡情况;qRT-PCR检测破骨细胞标志基因表达情况;TRAP染色检测破骨细胞分化情况;甲苯胺蓝染色检测破骨细胞骨吸收活性,检测SAL经低氧成骨细胞对破骨细胞活力、凋亡率、分化和骨吸收活性的影响。结果1.SAL对低氧成骨细胞HIF-1α通路的调控作用采用胰酶-胶原酶消化法提取C57/BL6乳鼠颅骨MOB,经碱性磷酸酶染色鉴定确为成骨细胞。MTT结果显示,与对照组相比,SAL（1 n M、10 n M、100 n M、1000 n M、10000 n M）可促进低氧成骨细胞活力,综合考虑选用1 n M～1000 n M作为后续实验药物浓度。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,低氧可促进成骨细胞HIF-1α通路中HIF-1α、VEGF、IL-6、ANGPTL4及RANKL基因表达,与低氧组相比,SAL上调VEGF的mRNA表达,下调HIF-1α、IL-6、ANGPTL4及RANKL的mRNA表达。Western blot结果显示,与对照组相比,低氧可促进成骨细胞HIF-1α的蛋白表达,与低氧组相比,SAL下调HIF-1α的蛋白表达。ELISA结果显示,与对照组相比,低氧可上调成骨细胞VEGF、IL-6、ANGPTL4及RANKL蛋白水平,与低氧组相比,SAL上调VEGF蛋白水平,下调IL-6、ANGPTL4及RANKL蛋白水平。2.SAL经低氧成骨细胞HIF-1α/VEGF、IL-6、ANGPTL4及RANKL通路对共培养破骨细胞表型表达的影响收集MC3T3-E1细胞及MOB培养上清作为条件培养基（CM）作用于RAW264.7细胞和BMMs,MTT结果显示,与低氧CM组相比,低氧CM+SAL组破骨细胞活力明显降低。流式结果显示,与低氧CM组相比,低氧CM+SAL组破骨细胞凋亡率明显升高。qRT-PCR结果显示,与低氧CM组相比,低氧CM+SAL组破骨细胞特异性分化标志基因RANK、TPRA、CTR及功能标志基因MMP-9、Cat K表达呈不同程度下调,加入阻断剂YC-1及中和抗体Avastin、Anti-IL-6、MBL、Denosumab后该作用减弱。TRAP染色结果显示,与低氧CM组相比,低氧CM+SAL组RAW264.7细胞TRAP阳性多核细胞数量减少,胞核数量减少,破骨细胞的分化受到抑制,加入阻断剂YC-1及中和抗体Avastin、Anti-IL-6、MBL、Denosumab后该作用减弱。甲苯胺蓝染色结果显示,与低氧CM组相比,低氧CM+SAL组RAW264.7细胞骨陷窝面积减少,体积减小,破骨细胞的骨吸收活性受到抑制,在加入阻断剂YC-1及中和抗体Avastin、Anti-IL-6、MBL、Denosumab后该作用减弱。结论1.低氧条件下SAL下调成骨细胞HIF-1α、IL-6、ANGPTL4、RANKL表达,上调VEGF表达。2.SAL通过调控低氧成骨细胞HIF-1α/VEGF、IL-6、ANGPTL4及RANKL通路抑制共培养破骨细胞的活力、标志基因的表达、分化和骨吸收活性及促进破骨细胞的凋亡。