为了制备转基因鸡输卵管特异性表达载体，用PstI直接从基因组上切下鸡卵清蛋白基因5’端4.65kb的启动子序列(简称OVp)，其中包括基因5’侧翼序列、第一外显子、第一内含子以及编码前140个氨基酸的DNA序列。 为了研究溶菌酶基因启动子的结构和功能，用PCR的方法克隆了鸡溶菌酶基因5’端521bp的启动子序列(简称LYS_P)和远端441bp增强子元件(简称LYS_E)。前者包含该基因起始密码子ATG和部分第一外显子以及完整的信号肽序列。后者含有雌二醇、皮质酮激素的调控位点。 由于MARs元件插入在基因的侧翼区和非编码区，通过和核基质结合，使插入的外源基因形成一个独立的表达活性单位，从而提高转基因的表达水平。本实验克隆了鸡珠蛋白基因MAR序列，完成了鸡珠蛋白基因MAR的pOVghMAR的构建，原代细胞转染结果并没有检测到含有MAR元件的载体表达量的增加，这可能是由于含有MAR的质粒只有整合到基因组上才能发挥作用，在瞬时表达体系中MAR的生物功能可能没有发挥出来。 人生长激素(hGH)基因含有5个外显子，4个内含子，全长1964bp。它的表达产物是一种分泌型的蛋白质，因而可以通过检测细胞培养液来确定基因是否表达。这样避免了细胞的破碎，并可连续检测细胞的瞬时表达。此外，由于考虑到hGH在大多数哺乳动物细胞中均具有很高的稳定性，因此选择hGH作为报告基因。 LYS_E作为增强子元件，hGH作为报告基因，以pBluescript、PUC19载体为基础，构建了pOVghMAR，pOVFgh，pELYSgh和pLYSgh四种输卵管特异性表达载体。用脂质体介导、电激法转染新鲜消化的鸡原代输卵管上皮细胞，细胞培养24小时后在培养液中检测到了外源基因的表达，48小时后表达量达到最高。基因导入方法的研究过程中，我们比较了脂质体介导法和电激法的转染效率，结果发现电激法明显优于脂质体法。 我们同样将上述四种载体直接注射到活体鸡输卵管，在输卵管注射段上皮细胞表面采取电场处理，手术后48小时杀鸡，应用放射性免疫 鸡输卵管特异性表达载体的构建和瞬时表达系统的研究试剂盒在输卵管细胞提取物中检测到了hGH表达。 但是由于我们整个体系的报告基因都采用人生长激素，而鸡体内也含有鸡生长激素，而且二者具有一定的同源性，所以在检测表达产物的过程中可能会造成背景误差。 总之，通过对输卵管特异性表达载体的构建，我们对制备转基因鸡输卵管通用表达载体的研究进行了一定的摸索，这将为禽类生物反应器的研究打下基础。输卵管上皮细胞原代培养和鸡活体输卵管瞬时表达体系的建立，为检测新型质粒构建是否具有表达功能提供了完整的应用平0ryo