【摘 要】
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近年来环境保护成为了热议话题,而在农业方面,农业杀虫剂的大量应用对环境造成了较大的危害,因此减少农业杀虫剂的使用是减少生态破坏的重要手段。生物杀虫剂可降解的优点对环境保护具有重要意义,研究可降解生物杀虫剂显得尤为重要。西柏三烯一醇主要存在于植物中,在抗虫方面具有良好的效果,但其在植物中含量稀少,直接提取不仅存在很多困难而且工艺复杂成本高昂,复杂的化学结构又难以化学合成。因此通过改造微生物利用合成生
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近年来环境保护成为了热议话题,而在农业方面,农业杀虫剂的大量应用对环境造成了较大的危害,因此减少农业杀虫剂的使用是减少生态破坏的重要手段。生物杀虫剂可降解的优点对环境保护具有重要意义,研究可降解生物杀虫剂显得尤为重要。西柏三烯一醇主要存在于植物中,在抗虫方面具有良好的效果,但其在植物中含量稀少,直接提取不仅存在很多困难而且工艺复杂成本高昂,复杂的化学结构又难以化学合成。因此通过改造微生物利用合成生物学等手段合成西柏三烯一醇引起了广泛兴趣。本研究中主要利用大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为出发菌株,通过对西柏三烯一醇合成途径构建及代谢改造来获得高产西柏三烯一醇的重组菌株,同时通过系统优化策略提高其产量。具体主要内容如下:（1）探究了2个植物来源西柏三烯醇合酶在S.cerevisiae中表达后催化生成西柏三烯一醇效率情况,筛选获得具有高效催化能力的西柏三烯醇合酶。通过在S.cerevisiae W303中异源表达西柏三烯一醇合成的2个关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶基因ggpps和西柏三烯醇合酶基因cbts*,实现了西柏三烯一醇在S.cerevisiae中的从头生产,产量可达到3.72μg·L-1。进一步过表达关键酶法尼基焦磷酸合成酶（ERG20）,获得的重组菌株的西柏三烯一醇产量提高至对照的1.84倍。将上述途径构建至S.cerevisiae BY4741中,其西柏三烯一醇的产量提高至S.cerevisiae W303的3倍。（2）将上述途径关键基因整合至S.cerevisiae菌株基因组上,获得了生产西柏三烯一醇的S.cerevisiae关键酶整合表达菌株。利用启动子Phxt1替换角鲨烯合成酶（ERG9）原来的启动子来敲低竞争途径麦角固醇途径,使碳代谢流更好的流向目的产物,与对照菌株相比较西柏三烯一醇产量提高了1.8倍。将含有关键酶基因ggpps和cbts*的游离质粒转入菌株S25中获得菌株S26将西柏三烯一醇产量提高至188.20μg·L-1,相对于只整合表达和弱化竞争途径的菌株S25西柏三烯一醇产量提高了26.02倍。基于区室化方法,在菌株S25的基础上将关键酶基因ggpps和cbts*定位到线粒体中获得重组菌株S27,西柏三烯一醇产量提高至283.98μg·L-1,提高至初始菌株的76.3倍。（3）通过在E.coli中关键酶基因ggpps和cbts,实现了西柏三烯一醇在E.coli中的从头生产,产量可达1.58×10-2 mg·L-1。比较了2个不同的西柏三烯醇合酶基因cbts和cbts*对西柏三烯一醇生产水平的影响,发现基因cbts*过量表达时更有利于西柏三烯一醇的生产,其产量提高至基因cbts过量表达时的20倍。过量表达磷酸戊糖（DXP）途径中关键酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs和异戊二烯焦磷酸异构酶基因idi,西柏三烯一醇生产水平提高至对照的3.75倍。进一步利用高考贝质粒表达基因dxs和idi的方式增加其表达量,西柏三烯一醇产量提高至对照的2.6倍。（4）采用共表达质粒表达基因的方法,系统调控关键基因ggpps、cbts*、dxs和idi的表达,西柏三烯一醇在E.coli中的产量提高至对照的1.53倍。过量表达关键酶法尼基焦磷酸合成酶基因isp A,其西柏三烯一醇在E.coli中的产量提高至对照的1.4倍。对发酵培养基及发酵时间进行优化,获得最适葡萄糖与酵母粉添加方式为葡萄糖:酵母粉=2:4,最适发酵周期为72 h时西柏三烯一醇在E.coli中的产量达53.72 mg·L-1。同时,在E.coli中重构了MEV途径,采用DXP途径和MEV途径双途径方式合成西柏三烯一醇,发酵至24 h时双途径方式显著促进了西柏三烯一醇的合成,提高至单一DXP途径的1.13倍。
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