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研究背景和目的:三叉神经痛(trigeminal neuralgia TN)是最常见的面部神经痛,且目前尚无理想的治愈方法。P2X7受体是ATP门控离子通道家族中的一员,研究表明其可能参与了痛觉信息的调制和传导。CGRP是一个传递痛觉信息的神经肽且有可能参与三叉神经痛的发生过程。长非编码核糖核酸(long noncoding RNA,lnc RNA)参与人类很多疾病基因调控,其表达的异常变化可能与神经系统疾病发病相关。本研究旨在使用长非编码核糖核酸uc.48+si RNA,干扰慢性压迫性损伤眶下神经(chronic constriction injury of the infraorbital nerve,ION-CCI)诱导形成的三叉神经痛模型大鼠三叉神经节(trigeminal ganglia,TG)长非编码核糖核酸uc.48+的表达,以及通过向正常大鼠TG转染uc.48+质粒,使正常大鼠TG中uc.48+过表达,来观察uc.48+对三叉神经痛的影响及可能机制。同时通过RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀)技术,研究与uc.48+相互作用的蛋白,为防治三叉神经痛探索新方法。方法:1.Lnc RNA uc.48+si RNA实验:将实验大鼠随机分为:假手术组(Sham);三叉神经痛模型组(TN);三叉神经痛模型+uc.48+小干扰处理组(TN+uc.48+si RNA);三叉神经痛模型+uc.48+小干扰阴性处理组(TN+scramble si RNA)四组。ION-CCI手术后第14天,经眶下孔局部三叉神经节注射uc.48+si RNA或scramble si RNA。通过行为学来观察各组大鼠面部机械痛阈值(MWT)的变化情况,各组大鼠注射后1、3、5天采用电子测痛仪进行MWT的测定。通过q PCR和蛋白印迹来检测各组大鼠三叉神经节中uc.48+、P2X7和CGRP的表达。采用免疫组化方法观察TG中P2X7和CGRP的表达,并通过免疫荧光双标的方法来检测TG中P2X7与GFAP(胶质细胞标记物)共表达的情况。采用ELISA检测各组大鼠血清炎性细胞因子1L-1β的变化情况。采用蛋白印迹实验检测uc.48+si RNA对TG中ERK1/2及其磷酸化程度的变化。2.转染lnc RNA uc.48+质粒过表达uc.48+实验:将实验大鼠随机分为:对照组(Control);转染pc DNA3.1-uc.48+质粒实验组(Control+uc.48+);转染pc DNA3.1空载质粒的阴性对照组(Control+vector)。经眶下孔局部注pc DNA3.1-uc.48+或pc DNA3.1空载质粒。通过行为学来观察各组大鼠面部机械痛阈值的变化情况,各组大鼠注射后1、3、5天采用电子测痛仪进行机械痛阈值(MWT)的测定。通过q PCR和蛋白印迹来检测各组大鼠TG中uc.48+、P2X7和CGRP的表达。通过免疫荧光双标的方法来检测三叉神经节(TG)中P2X7与GFAP共表达的情况。采用Elisa检测各组大鼠血清炎性细胞因子1L-1β的变化情况。采用蛋白印迹实验检测过表达uc.48+对ERK1/2磷酸化程度的影响。3.运用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)检测uc.48+和P2X7受体之间的相互作用。结果:1.Lnc RNA uc.48+si RNA实验结果:注射小干扰之前,测各组大鼠机械痛敏阈值,TN、TN+uc.48+si RNA和TN+scramble si RNA三组与Sham组相比,机械痛敏阈值明显降低(p<0.01),表明模型制备成功。uc.48+小干扰3天之后开始,TN+uc.48+si RNA组机械痛敏阈值明显增加,与TN组相比有显著性差异(p<0.01),而TN组与TN+scramble si RNA组相比无统计学意义(p>0.05);uc.48+小干扰5天后,TN+uc.48+si RNA与TN模型组相比uc.48+的表达量明显降低,有统计学意义(p<0.05),说明uc.48+si RNA干扰比较成功。q PCR和蛋白印迹结果显示:与Sham组比较,TN与TN+scramble si RNA组中P2X7、CGRP m RNA和蛋白的表达水平明显升高(P<0.01);给予uc.48+小干扰处理后,TN+uc.48+si RNA组P2X7、CGRP m RNA和蛋白的表达较TN组明显降低,有统计学意义(p<0.05),而TN组与TN+scramble si RNA组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。免疫组化的实验结果显示:给予uc.48+小干扰处理后,TN+uc.48+si RNA组P2X7、CGRP的表达较TN组明显降低,有统计学意义(P<0.01),而TN组与TN+scramble si RNA组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。免疫荧光双标的方法结果显示:TG细胞中P2X7和GFAP存在共表达,与Sham组比较,TN与TN+scramble si RNA组中P2X7的表达明显增加;给予uc.48+小干扰处理后,TN+uc.48+si RNA组P2X7的表达较TN组明显降低。ELISA检测大鼠血清IL-1β结果表明:TN与TN+scramble si RNA组中IL-1β的表达水平与Sham组比较明显升高(P<0.01);给予uc.48+小干扰处理后,TN+uc.48+si RNA组IL-1β的表达较TN组明显降低,有统计学意义(P<0.01)。采用蛋白印迹方法测量TG中ERK1/2磷酸化程度,结果表明:各实验组中ERK1/2对β-actin的积分光密度比值无统计学意义(p>0.05),与Sham组比较,TN与TN+scramble si RNA组中p-ERK1/2对ERK1/2的积分光密度比值显著升高,ERK1/2磷酸化程度明显增强(P<0.05);给予uc.48+小干扰处理后,TN+uc.48+si RNA组ERK1/2磷酸化水平较TN组明显降低(P<0.05)。2.转染lnc RNA uc.48+质粒过表达uc.48+实验结果:注射uc.48+质粒之前,测各组大鼠机械痛敏阈值,control、control+uc.48+和control+vector三组之间无明显差异。注射过表达uc.48+质粒3天之后,与control组相比control+uc.48+组机械痛敏阈值明显降低(p<0.01),control和control+vector组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。q PCR检测表明:uc.48+质粒转染5天后,control+uc.48+组TG中uc.48+m RNA的表达水平较control明显增加,有统计学意义(p<0.01),而control和control+vector组相比其差异无统计学意义(p>0.05),说明uc.48+质粒转染成功。q PCR和蛋白印迹结果显示:control+uc.48+组TG中P2X7、CGRP m RNA和蛋白的表达水平较control组明显增加,有统计学意义(p<0.05),control和control+vector组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。免疫组化实验结果表明:control+uc.48+组TG中P2X7、CGRP表达水平较control组明显增加,有统计学意义(p<0.01),control和control+vector组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。免疫荧光双标的方法测量结果显示:TG细胞中P2X7受体和GFAP存在共表达;control+uc.48+组TG中P2X7与GFAP表达量较control和control+vector组明显增加。ELISA检测大鼠血清IL-1β结果表明:control+uc.48+组血清IL-1β较control组明显增加,有统计学意义(p<0.01),control和control+vector组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。蛋白印迹方法测量TG中ERK1/2磷酸化程度的变化,结果表明:各组中ERK1/2对β-actin的积分光密度比值无统计学意义(p>0.05);control+uc.48+组TG中p-ERK1/2对ERK1/2的积分光密度比值升高,ERK1/2磷酸化水平较control组明显增加,有统计学意义(p<0.01),control和control+vector组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。3.RIP结果显示:实验组pc DNA3.1-uc.48+-12×MS2bs和pc DNA3.0-Flag-2×MS2质粒共转染组与对照组pc DNA3.1-12×MS2bs和pc DNA3.0-Flag-2×MS2质粒共转染组相比,P2X7被显著富集,说明P2X7受体特异性地与uc.48+相结合。结论:小干扰uc.48+可以抑制三叉神经痛的痛觉传递,而过表达uc.48+可促进三叉神经痛的痛觉传递,其机制可能如下:lnc RNA uc.48+可促进TG的P2X7、CGRP表达上调,导致IL-1β的水平升高,TG的ERK1/2磷酸化水平增强,进而影响三叉神经痛的痛觉传递;而使用uc.48+小干扰过后可抑制其相应的以上表达,起到缓解疼痛的作用。