小麦叶锈病是由小麦叶锈菌（Puccinia triticina,Pt）侵染引起的一种影响世界小麦生产安全的重要病害,在我国多次发生大流行,造成严重损失。培育小麦抗叶锈病品种,是防治小麦叶锈病最经济、安全、有效的方法。本课题组前期克隆的小麦抗叶锈病基因Lr13,该基因是典型的CC-NBS-LRR基因。本研究通过酵母双杂交技术筛选与Lr13互作的抗病因子,并利用酵母一对一回复试验和双分子荧光互补试验初步验证得到3个与Lr13互作抗病因子:Psb29（photosystem Ⅱbiogenesis protein,Psb29/THF1）、HSP70 与丝氨酸羟基转移酶（Serine Hydroxymethyl transferase,SHMT）,对3个基因进行亚细胞定位分析;利用qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）检测分析发现这3个互作靶标受非生物胁迫、激素与小麦叶锈菌的诱导情况。主要研究结果如下:1.小麦cDNA酵母文库构建使用非亲和小麦叶锈生理小种FHDS接种小麦材料周麦22,取样后将样品送往上海欧易公司进行核体系小麦cDNA酵母文库的构建,构建完成后,经检测文库符合标准,可进行下一步筛库工作。2.pGBKT7-Lr13重组载体自激活验证成功构建pGBKT7-Lr13重组载体,进行自激活验证,发现Lr13基因有自激活活性。将CC、NB、LRR结构域分别连接到pGBKT7载体后发现CC结构域、LRR结构域没有自激活活性,NB结构域有自激活活性,因此选用pGBKT7-CC、pGBKT7-LRR重组载体进行酵母双杂交筛库试验。3.酵母双杂交筛库将含有pGBKT7-CC、pGBKT7-LRR重组载体酵母菌液与酵母文库AD菌液mating,筛选蓝色克隆,并使用pGADT7载体通用引物对蓝色克隆进行扩增,选择条带大小有差异的条带进行测序,使用NCBI 网站对测序结果进行BLAST序列比对,CC结构域和LRR结构域均筛到7个不同候选互作靶标。4.酵母一对一回复验证对LRR结构域筛库结果进行回复验证,将7个候选互作靶标与Lr13进行酵母回复实验,得到3个互作靶标:Psb29、HSP70和SHMT。利用酵母双杂技术分析Psb29、HSP70和SHMT与CC、NB、LRR结构域之间的互作力度,结果表明:Psb29、HSP70和SHMT基因与CC结构域、LRR结构域均互作,其中Psb29基因与CC结构域的互作力度更强,HSP70基因与CC结构域和LRR结构域的互作力度基本相同,而SHMT基因与LRR结构域的互作力度更强。5.双分子荧光互补试验成功构建重组载体 pSPYCE-Lr13、pSPYNE-Psb29、pSPYNE-HSP70 与pSPYNE-SHMT后进行农杆菌转化,在烟草叶片中进行荧光观察,Psb29、HSP70和SHMT均在细胞质中观察到荧光信号,再次证明Psb29、HSP70和SHMT与Lr13互作。6.亚细胞定位成功构建Psb29-EGFP、HSP70-EGFP、HSP70-EGFP（去信号肽）和SHMT-EGFP重组载体,进行农杆菌转化后注射烟草并观察荧光。结果显示:Psb29基因定位在细胞质和细胞核;HSP70基因定位在细胞质,去掉信号肽后定位在细胞质和细胞核;SHMT基因定位在细胞质。7.基因Psb29、HSP70和SHMT表达模式分析利用qRT-PCR检测Psb29、HSP70和SHMT基因在小麦材料周麦22不同组织中的表达量,结果表明,Psb29、HSP70和SHMT基因在组织中均有表达。使用PEG溶液、NaCl溶液、SA溶液、ABA溶液和MeJA溶液对周麦22处理后发现,三个基因均受其诱导,Psb29基因在PEG和SA处理下表达上调,在NaCl、MeJA和ABA处理下表达下调;HSP70基因在MeJA处理下表达上调,其它处理表达均下调;SHMT基因在PEG和ABA处理下表达上调,其它处理均下调。使用非亲和小麦叶锈生理小种处理周麦22,Psb29基因和HSP70基因表达均上调,而SHMT基因的表达呈下调趋势。