【摘 要】
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颗粒细胞是影响绵羊卵泡发育的关键因素,miRNA通过控制卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡影响绵羊的繁殖性能。绵羊体内血糖浓度为1.5-4 mmol/L,采用葡萄糖浓度为17.5 mmol/L的DMEM/F12培养基体外培养的绵羊颗粒细胞周期及衰老相关分泌表型相关基因发生了改变,推测培养基中高浓度葡萄糖对细胞周期产生了影响,首先采用不同浓度葡萄糖培养基培养绵羊卵泡颗粒细胞,利用CCK-8、EdU、划痕实验、
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颗粒细胞是影响绵羊卵泡发育的关键因素,miRNA通过控制卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡影响绵羊的繁殖性能。绵羊体内血糖浓度为1.5-4 mmol/L,采用葡萄糖浓度为17.5 mmol/L的DMEM/F12培养基体外培养的绵羊颗粒细胞周期及衰老相关分泌表型相关基因发生了改变,推测培养基中高浓度葡萄糖对细胞周期产生了影响,首先采用不同浓度葡萄糖培养基培养绵羊卵泡颗粒细胞,利用CCK-8、EdU、划痕实验、β-半乳糖苷酶染色、qRT-PCR和RNA-Seq等技术,筛选出最适宜的葡萄糖浓度;novel-miR-23900是新发现的miR-134家族成员,前期研究发现FSH处理后绵羊卵泡颗粒细胞后novel-miR-23900和ID1基因表达量显著下调,采用适宜葡萄糖浓度的培养基培养绵羊卵泡颗粒细胞,在细胞中进行过表达/抑表达ID1、转染novel-miR-23900 mimic 和 mimic NC,利用 CCK-8、EdU、JC-1、qRT-PCR 和 RNA-Seq 等技术,研究novel-miR-23900/ID1轴调控绵羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的分子机制。主要研究结果如下:CCK-8和EdU结果发现2 mmol/L葡萄糖培养基培养的颗粒细胞增殖能力最高,2 mmol/L葡萄糖组的颗粒细胞迁移能力显著高于6、17.5 mmol/L葡萄糖组（P＜0.05）,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率显著低于6、17.5 mmol/L葡萄糖组（P＜0.05）,2mmol/L葡萄糖组中p21和p53基因的表达量显著下降（P＜0.05）,且RBL1、FOXM1、MYBL2、CDK2和CDK4基因的表达量显著上升（P＜0.05）。β-半乳糖苷酶染色结果发现H组（17.5 mmol/L）阳性细胞数百分比极显著高于L组（2 mmol/L）（P＜0.01）,H组和L组间存在401个差异表达基因,其中上调基因153个,下调基因248个,与高糖诱导的细胞异常相关基因9个,与细胞周期相关基因6个。GO功能富集分析发现差异表达基因在生物过程、细胞组分和分子功能均显著富集。KEGG通路富集分析发现差异表达基因主要富集在糖尿病并发症中的晚期糖基化产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路等。与L组相比,H组IL-8、ID1、ANKRD1和novel-miR-23900基因表达水平极显著或显著上调（P＜0.01或P＜0.05）,OXT基因表达水平极显著下调（P＜0.01）,NOX4基因表达水平差异不显著（P＞0.05）,实时荧光定量PCR数据表达趋势与转录组测序结果一致。根据不同葡萄糖浓度的研究结果,后续实验选择2 mmol/L浓度葡萄糖培养颗粒细胞。过表达ID1后novel-miR-23900基因表达量极显著升高（P＜0.01）、细胞增殖能力降低、JC-1绿色荧光极显著增强（P＜0.01）,CDK2、CDK4、CCND2和Bcl2基因表达量显著降低（P＜0.05）,Bax和Casp3基因表达量显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;抑表达ID1后novel-miR-23900基因表达量极显著降低（P＜0.01）,颗粒细胞增殖能力升高、JC-1绿色荧光极显著减弱（P＜0.01）,CDK2、CCND2和Bcl2基因表达量极显著升高（P＜0.01）,CDK4基因表达量显著升高（P＜0.05）,Bax基因表达量显著降低（P＜0.05）。过表达novel-miR-23900的颗粒细胞增殖能力降低,EdU阳性细胞率极显著降低（P＜0.01）,JC-1绿色荧光极显著增强（P＜0.01）,Bax和Casp3基因表达量显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;CDK1、CDK2、CDK4、CCNB1、CCNB2、CCND1、CCND2和Bcl2基因表达量显著或极显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,ID1基因表达量极显著升高（P＜0.01）。novel-miR-23900处理细胞48h后,与细胞增殖和凋亡相关的差异表达基因有10个,其中下调基因Bub1、CDC20和mps1主要富集在细胞周期信号通路。综上所述,高浓度葡萄糖（17.5 mmol/L）影响细胞周期/衰老相关基因表达水平,诱导细胞衰老,抑制颗粒细胞增殖;novel-miR-23900和ID1之间存在互作关系,两者相互作用抑制了颗粒细胞的增殖,促进了颗粒细胞的凋亡,表明novel-miR-23900/ID1轴在绵羊卵泡颗粒细胞中发挥重要作用。
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