新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)是围生期窒息所引起的新生儿脑损伤，足新生儿死亡及儿童致残的丰要原因。该病尚无有效的治疗方案。目前均立足于用多种脑细胞活性药物抑制细胞凋亡，并通过功能锻炼促进其功能改善，但对已经死亡的脑细胞则无能为力。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是中胚层分化而成的一种非造血成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。近年来研究表明，MSCs在体外合适的诱导条件下，可向神经细胞分化，并具有在体内向脑缺血损伤部位定向迁移的能力，提示可用MSCs移植治疗中枢神经系统损伤。 1.目的 从正常人骨髓中分离培养、扩增和纯化MSCs，研究其生物学特性；体外诱导MSCs向神经样细胞定向分化。建立切实可行的体外培养和诱导实验条件，为研究MSCs作为一种中枢神经系统疾病移植治疗的新的细胞来源提供理论依据和实验基础。 2.方法 2.1人骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增及免疫表型鉴定采用密度梯度离心法从正常人骨髓中分离出单个核细胞，体外培养获得MSCs，进行体外扩增培养和纯化实验。取生长状态良好的P5代hMSCs,用流式细胞仪检测hMSCs免疫表型。 2.2 hMSCs的多向分化潜能 2.2.1体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞取第5代细胞，体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞，进行油红O染色鉴定脂肪细胞。 2.2.2体外定向诱导hMSCs分化为成骨细胞取第5代细胞，用成骨细胞诱导液定向诱导hMSCs分化为成骨细胞，进行茜素红染色鉴定。 2.2.3体外抗氧化剂β-巯基乙醇定向诱导hMSCs分化为神经样细胞取传至第3代的hMSC，体外抗氧化剂β-巯基乙醇定向诱导分化为神经样细胞。通过免疫细胞化学染色检测诱导后的细胞神经干细胞标记物Nestin、神经元标志物NF和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。 3.结果 3.1 hMSCs的分离、培养、扩增及免疫表型鉴定从骨髓分离出单个核细胞，接种24h后可见有圆形的贴壁细胞。在原代培养约12-15天左右，细胞可达到80-90％融合。hMSCs传至第三代，细胞较为均一，杂细胞逐渐消失。流式细胞技术(Flow-cytometry，FCM)结果显示P5代hMSC均一性可达95％以上，膜抗原CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86表达为阴性，而膜抗原CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性。表明MSCs是存在于骨髓中区别于造血细胞的一群处于未分化状态的非定向干／祖细胞。 3.2 hMSCs的多向分化潜能3.2.1 体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。诱导4天后，光镜下可见有脂滴沉着的细胞。于第14天进行油红O染色，脂滴呈橙红色，大小不等，细胞核被脂滴挤于细胞的一侧。 3.2.2体外定向诱导hMSCs分化为成骨细胞。14天后可见钙沉积出现。在诱导培养21天后，用茜素红进行染色，钙结节呈桔红色3.2.3抗氧化剂β-巯基乙醇诱导hMSCs分化为神经样细胞。 4.结论 4.1在适宜的体外培养条件下，可从人骨髓中成功分离培养出hMSCs，并且在体外可以大量扩增hMSCs。 4.2分离培养的hMSCs具有多向分化潜能，能在体外定向诱导成脂肪细胞、成骨细胞，免疫表型符合人间充质干细胞特征。 4.3 hMSCs在体外诱导培养和特定的微环境条件下，能分化为神经元和星形胶质细胞。 第二章人骨髓间充质干细胞两种标记方法的对比研究 1.目的 在体外利用荧光染料CM-DiI直接标记hMSCs以及慢病毒转染hMSCs使其表达EGFP，比较两种方法的标记效率以及标记率随细胞传代次数的影响，并将两种不同方法标记的hMSCs移植入新生大鼠侧脑室内，进行体内预试验，比较两种标记方法用于体内示踪的优缺点，为下一步的动物体内移植实验打下基础。 2.方法 2.1利用5μM浓度荧光染料CM-DiI直接标记p3代hMSCs，倒置相差显微镜下观察细胞的状态、生长情况，荧光倒置显微镜下观察标记情况及标记率。 2.2使用FUGw质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体，并利用慢病毒转染p3代hMSCs，使其表达EGFP，荧光倒置显微镜下观察转染后细胞的状态、生长情况、及转染效率。 2.3分别将CM-DiI标记和慢病毒转染的p3代hMSCs在体外传代培养至p9代(体外生长1个月)，比较传代前后标记效果的差异。 3.结果 3.1利用5μM浓度的CM-DiI标记p3代hMSCs 12小时后，荧光倒置显微镜下观察到绝大部分细胞呈现红色荧光，荧光强度较强，主要为细胞膜着色，细胞核未见荧光，标记效率很高(约95％以上)。相差显微镜下可见标记后细胞形态与标记前相同，细胞牛长状态良好，染料对细胞毒性较小。 3.2利用慢病毒转染p3代hMSCs48小时后，荧光倒置显微镜下可观察到部分细胞表达绿色荧光，荧光强度不一，整个细胞均呈现绿色，可观察到完整的细胞形态，转染效率约40％左右。转染后的细胞形态与转染前相同，细胞生长情况良好，仅见很少量的死细胞，随着时间延长，GFP阳性细胞数目逐渐增多，到第5天GFP阳性细胞数达到峰值，约50％~60％。 3.3 CM-DiI标记的p3代hMSCs在体外经传代培养1个月后，阳性细胞明显减少(约50％左右)，荧光强度也有一定程度降低；慢病毒转染的p3代hMSCs在体外经传代培养1个月后，阳性细胞略有增多，荧光强度基本保持不变，EGFP基因整合到细胞基因组后得以稳定表达。 4.结论 4.1成功利用荧光染料CM-DiI标记hMSCs，标记效率很高，荧光强度也较强，未见染料对细胞形态和生长产生明显影响。 4.2成功利用慢病毒对hMSCs进行高效转染，转染后的细胞表达EGFP，细胞生长基本不受病毒转染的影响。 4.3 CM-DiI标记的hMSCs标记效率随着体外培养时间的延长逐渐降低，荧光强度也逐渐减弱；而慢病毒转染的hMSCs转染效率不受体外培养时间的延长而变化，绿色荧光稳定、持久表达。 第三章人骨髓间充质干细胞移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑病的实验研究 1.目的 研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)经脑室移植后对新生鼠缺氧缺血性脑病模型的治疗作用，对大鼠远期学习记忆功能的影响；观察植入细胞的存活、迁移及分化情况。为进一步进行MSCs移植治疗新生儿HIE的临床应用提供实验基础和理论根据。 2.方法 2.1 体外分离、扩增正常人骨髓间充质干细胞，移植前用CM-DiI标记。 2.2 7日龄新生SD大鼠随机分为假手术组(n=20)、HIE／PBS组(n=20)、HIE／hMSCs治疗组(n=50)。 2.3 HIE／hMSCs治疗组建立HIE模型后72h，将hMSCs(1 ×105／u1)5μL采用立体定向移植到乳鼠侧脑室。 2.4 30只实验鼠(每组10只)在移植后4周时(日龄38.42天)行Morris水迷宫实验检测其学习记忆功能。 2.5完成Morris水迷宫实验后(日龄42天时)，30只实验鼠(每组10只)处死取脑固定后常规制成石蜡切片，HE染色记数海马CAl区存活神经元数。 3.结果 3.1 Morris水迷宫实验结果HIE／hMSCs组大鼠的空间学习记忆功能有所改善。水迷宫平均逃逸潜伏期HIE／hMSCs组[(71.77+19.37)S]比HIE／PBS组[(85.584-19.82)s1短(P<0.01)，但较假手术组[(47.124-21.22)s]长(P<0.01)。原平台象限的搜索时间为HIE／hMSCs组[(44.48+6.44)s]较HIE／PBS组[(32.904-6.18)s]长(P