【摘 要】
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奶牛乳房炎的诱发因素有很多,一般由病原微生物感染引起。当病原微生物入侵奶牛乳腺组织后引起局部或全身性炎症,使得产奶量下降和乳品质降低,给奶业造成了极大的经济损失。因此,亟需加强奶牛乳房炎的分子调控机制研究,挖掘调控奶牛乳房炎的基因,研发奶牛抗乳房炎分子育种技术,以切实提高奶牛的抗乳房炎能力。近年来,学者们在奶牛乳房炎的易感性和抗病性方面开展了大量的研究工作,但是,其分子调控机制尚未完全阐明,仍有很
【基金项目】
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国家自然科学基金地区项目（31960652）； 宁夏重点研发项目（引才专项）（2019BEB04002）；
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奶牛乳房炎的诱发因素有很多,一般由病原微生物感染引起。当病原微生物入侵奶牛乳腺组织后引起局部或全身性炎症,使得产奶量下降和乳品质降低,给奶业造成了极大的经济损失。因此,亟需加强奶牛乳房炎的分子调控机制研究,挖掘调控奶牛乳房炎的基因,研发奶牛抗乳房炎分子育种技术,以切实提高奶牛的抗乳房炎能力。近年来,学者们在奶牛乳房炎的易感性和抗病性方面开展了大量的研究工作,但是,其分子调控机制尚未完全阐明,仍有很多功能基因及其调控作用有待于进一步挖掘与探索。因此,本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导奶牛乳腺上皮细胞,成功构建奶牛乳房炎细胞炎症模型;并将miR-382过表达或沉默后,通过转录组测序、实时荧光多聚酶链式反应（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）、双荧光素酶报告基因实验（dual luciferase reporter gene assay）、酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、Western Blot 实验、CCK-8 和流式细胞术（Flow cytometry）等实验阐明 miR-382 在奶牛乳房炎中的分子调控作用。得到以下主要实验结果:（1）过表达miR-382后通过RNA-Seq技术获得134个上调和40个下调的差异表达mRNA;功能富集的结果表明,miR-382主要参与调节T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路、IL-17信号通路和PI3K/AKT等三十余种信号通路,影响细胞通讯、信号转导和对刺激的应答等生物学过程,对细胞外隙、胞外区和细胞外基质,以及肽酶调节活性等具有显著影响;（2）在LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞0、3、6、12和24h,采用qRT-PCR技术检测了 miR-382及促炎细胞因子IL-6、IL-1β和IL-8的表达量。结果表明,与0h相比,miR-382在LPS诱导3和12h后的表达量极显著上调（p＜0.001）,诱导6h的表达量最高（p＜0.0001）,24h的表达量上调不显著（p＞0.05）;IL-6、IL-1β和IL-8在LPS诱导3、6、12和24h后的表达量均极显著上调（p＜0.01）,说明本研究成功构建了奶牛乳腺上皮细胞炎症模型;（3）采用生物信息学方法预测了 miR-382的靶基因,共筛选出PTEN、NK4P和GRK5等18个候选靶基因,成功构建了 18个候选靶基因的3’UTR-psiCHECKTM-2野生型载体,并采用双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Western Blot实验对候选靶基因进行鉴定。结果表明,miR-382可直接靶向GRK5基因的3’UTR区,抑制了 GRK5基因mRNA水平和蛋白质水平的表达;（4）miR-382在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中的功能研究结果表明,LPS可激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路;过表达miR-382可抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中PI3K、AKT和NF-κB的表达,进而抑制促炎细胞因子IL-6、IL-1β和IL-8的分泌,增强细胞活力和抑制细胞凋亡;抑制miR-382后得到了与过表达miR-382相反的结果。综上所述,miR-382在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中表达上调,可靶向抑制GRK5基因的表达,并通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应和细胞凋亡,并增强细胞活力。研究结果从细胞水平揭示了 miR-382在奶牛乳房炎中的功能,为奶牛乳房炎分子调控网络解析和抗乳房炎分子育种提供了参考依据。
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