鸭肠炎病毒(DEV)诱导鸭胚成纤维细胞(DEF)内质网应激介导的自噬和凋亡及相关机制研究

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鸭病毒性肠炎(Duck virus enteritis,DVE),又称鸭瘟(Duck plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭,鹅等禽类的一种急性、接触性传染病。其特征是死亡率高,给养鸭业带来巨大的经济损失。DEV又称鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV),属于疱疹病毒科。近年来,有研究表明DEV可以引起鸭胚成纤维(Duck embryo fibroblast,DEF)细胞自噬。且高感染性病毒可以通过影响细胞内Ca2+失衡,导致DEF细胞死亡。此外,DEV可通过内质网应激相关的未折叠蛋白的反应诱导自噬。目前,人们把研究的焦点集中于DEV分子生物学,对于相关细胞感染DEV后细胞功能及相关机制研究较少。本研究以自噬和内质网应激为研究对象,探讨DEV诱导DEF内质网应激介导的细胞自噬和凋亡以及相关机制研究,为阐明DEV感染DEF机理提供相关理论基础,为鸭瘟的预防与控制提供相关思路。主要研究内容如下:1.不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的DEV对DEF增殖和凋亡的影响:采用0.1MOI,1MOI和10MOI的DEV感染DEF,CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示:DEV浓度越高,细胞活力越低,细胞凋亡越高。1MOI的DEV感染DEF后,细胞活力明显下降,10MOI的DEV感染DEF后,细胞活力降至50%以下。2.不同MOI的DEV对DEF内Ca2+水平、自噬及内质网应激相关蛋白水平的影响:采用0.1MOI,1MOI和10MOI的DEV感染DEF,荧光探针Fluo-4检测Ca2+水平,WB检测自噬相关蛋白LC3-I,LC3-II,内质网应激相关蛋白CHOP,GRP78和ATF6表达水平。结果显示:DEV诱导Ca2+水平,上调LC3-II/LC3-I表达,同时CHOP,GRP78和ATF6表达水平均上调,且与DEV的浓度呈剂量效应关系。3.Ca2+螯合剂逆转DEV对DEF感染作用:使用10MOI的DEV感染DEF后,添加10m M Ca2+螯合剂(EDTA),荧光探针Fluo-4检测Ca2+水平,CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,WB检测自噬相关蛋白LC3-I,LC3-II,内质网应激相关蛋白CHOP,GRP78和ATF6表达水平。结果显示:Ca2+螯合剂可显著促进DEV介导的DEF增殖活力,降低DEV诱导的细胞凋亡,同时,Ca2+螯合剂可以降低LC3-II/LC3-I表达,降低CHOP,GRP78和ATF6表达。结论:DEV抑制DEF的增殖,促进DEF的凋亡,同时促进细胞外钙离子流动,诱导DEF内质网应激和自噬且存在浓度依赖性;而Ca2+螯合剂可以逆转DEV对DEF感染作用。
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