背景:支气管哮喘（简称哮喘）是儿童最常见的气道慢性炎症性疾病。近年来,世界范围内哮喘的发病率和死亡率逐渐上升,这使人类的健康受到了极其大的威胁,也使整个家庭和整个社会背负了巨额的经济负担。哮喘已经成为全球范围内亟待解决的公共卫生难题,从哮喘发病机制层面寻找干预措施是临床急需要解决的实际问题。哮喘的发病机制极为复杂,目前其具体的发病机制尚无确切定论。辅助性T细胞1型（Th1）功能受到抑制,辅助性T细胞2型（Th2）功能亢进所导致的Th1/Th2不平衡目前被认为是导致哮喘发病最主要的原因。但仅仅依靠Th1/Th2失衡的理论并不能解释所有实验现象,哮喘的发生可能涉及更多其它的细胞群体。随着Th9细胞这个新的CD4+Th细胞亚群的发现,越来越多的研究开始关注这群细胞在哮喘免疫病理中的作用。Th9细胞是IL-4和TGF-β刺激Na（?）ve CD4+T细胞分化而来的,同时产生大量的IL-9。分泌IL-9的Th9细胞在哮喘免疫病理中起着重要的作用。近年来,起初被认为是转录组“噪音”的microRNAs（miRNAs）日益受到研究者的关注,miRNA是非编码RNA,长度为18～25个核苷酸,在进化过程中高度保守,它们与信使RNA（message RNA,mRNA）的 3’非翻译区（3’Untranslated Regions,3’UTR）结合后能够导致基因翻译受到抑制,进而降低靶基因的表达,在许多疾病发病机制中的作用已被广泛研究。越来越多的证据表明miRNAs参与哮喘的气道炎症调节,本课题通过高通量测序再结合GO分析、KEGG信号通路分析、信息学分析和已发表的数据库筛选出哮喘组和对照组差异表达的miRNAs,即miR-493-5p,探讨其在哮喘中对Th9细胞分化的影响。第一部分哮喘患儿外周血miR-493-5p、FOXO1、IL-9的表达及临床意义目的:探讨哮喘患儿外周血miR-493-5p、FOXO1和IL-9的表达情况及与临床资料、相关实验室检查等之间的关联性。方法:1、选取2017年9月～2019年6月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院的哮喘患儿30例,纳入标准参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》,选取同一时间范围内在苏州大学附属儿童医院外科行择期手术的患儿32例作为健康对照组。同时收集两组患儿的临床资料及相关实验室检查,包括性别、年龄、哮喘患儿外周血嗜酸性粒细胞比例、外周血总IgE水平、FEV1%、FeNO、住院天数等。2、收集哮喘组和健康对照组患儿外周血标本,通过高通量测序再结合GO分析、KEGG信号通路分析、信息学分析和已发表的数据库筛选出差异表达的miRNAs。3、qRT-PCR（荧光实时定量PCR）检测两组患儿外周血miR-493-5p、FOXO1、IL-9的表达情况,并进行相关性分析;用哮喘组患儿外周血miR-493-5p的表达水平与临床资料及相关实验室检查进行相关性分析。结果:1、高通量测序及验证发现哮喘患儿外周血miR-493-5p与健康对照组相比呈显著降低且可能与Th细胞分化有关。2、与健康对照组相比较,哮喘组患儿外周血miR-493-5p的表达水平明显降低,差异有统计学意义（p＜0.05）;而外周血FOXO1、IL-4和IL-9的表达水平与健康对照组相比则明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。3、哮喘患儿外周血miR-493-5p的表达水平与FOXO1（r=-0.519,P＜0.05）、IL-9（r=-0.684,P＜0.01）、IL-4（r=-0.589,P＜0.01）、外周血嗜酸性粒细胞比例（r=-0.671,P＜0.01）、外周血总 IgE 水平（r=-0.631,P＜0.01）、FEV1%（r=-0.827,P＜0.01）、FeNO水平（r=-0.726,P＜0.01）均有负相关关系;但是与哮喘患儿的年龄（r=0.180,P＞0.05）和住院天数（r=0.117,P＞0.05）不存在相关性。结论:哮喘患儿体内miR-493-5p的表达水平是降低的,且与FOXO1、IL-9、IL-4、外周血中过敏性炎症指标、FEV1%和FeNO均呈负相关。第二部分MiR-493-5p/FOXO1/Th9细胞逐级调控的作用及机制目的:预测并且验证miR-493-5p的靶基因是FOXO1,探讨miR-493-5p通过靶向作用于FOXO1调控Th9细胞分化的机制。方法:1、分选 WT 小鼠 Na（?）ve CD4+T 细胞,将 miR-493-5p mimic 和 miR-493-5p inhibitor转染入Naive CD4+T细胞,在Th9诱导分化培养体系中培养7d后采用流式细胞仪和ELISA检测IL-9的表达水平,同时用qRT-PCR和Western Blot检测miR-493-5p、FOXO1、IRF4、IL-9的mRNA水平和蛋白水平。2、通过TargetScan、starBase v2.0等软件分析miR-493-5p的生物学信息及其可能的靶基因;通过双荧光素酶报告基因实验验证FOXO1是miR-493-5p的靶基因。3、构建FOXO1过表达质粒和FOXO1小干扰质粒,在Th9诱导分化培养体系中分别转染Na（?）ve CD4+T细胞,通过挽救实验进一步验证miR-493-5p对Th9细胞分化的影响是通过靶向作用于FOXO1来实现的。结果:1、在诱导Na（?）ve CD4+T细胞向Th9方向分化时,细胞中过表达miR-493-5p可下调FOXO1、IL-9和IRF4的mRNA 水平和蛋白水平,而沉默miR-493-5p可上调FOXO1、IL-9和IRF4的mRNA水平和蛋白水平,提示过表达或沉默miR-493-5p可以抑制或促进Th9细胞分化。2、TargetScan、starBase v2.0 等软件预测结果显示 FOXO1 可能是 miR-493-5p 的直接靶基因。双荧光素酶结果表明miR-493-5p能够直接结合FOXO1基因3’UTR区从而下调FOXO1的表达,明确了 FOXO1是miR-493-5p的靶基因。3、挽救实验的设计采用共转染的方式来实现,从mRNA水平和蛋白水平均验证了过表达FOXO1能够挽救miR-493-5p抑制的Th9细胞分化。结论:miR-493-5p通过靶向作用于FOXO1抑制Th9细胞的分化和IL-9的产生,提示miR-493-5p有望作为治疗哮喘的潜在靶点。第三部分过表达miR-493-5p在OVA致敏的哮喘模型中的作用目的:构建OVA致敏的哮喘小鼠模型,给予miR-493-5p agomiR干预以达到体内miR-493-5p的过表达状态,探讨miR-493-5p在哮喘发病机制中调控Th9细胞分化的作用。方法:1、将 6～8w 的雌性 BALB/c 小鼠随机分成 4 组:Control group、Asthma group、miR-493-5p agomiR group 和 agomiRNC group,每组 8 只。2、构建OVA哮喘模型:第0d和第7d给予腹腔注射OVA致敏混合溶液100μl/只;第17d、18d、19d、20d进行OVA雾化激发;第21d收集肺组织、BALF以及血浆等进行后续检测。miR-493-5p agomiR group在第14d、15d、16d通过滴鼻方式给予 miR-493-5p agomiR 40μl。3、在OVA最后一次激发24h后,使用小鼠无创肺功能仪测定各组小鼠对不同浓度乙酰甲胆碱激发后表现出的气道反应性。采用HE染色、气道炎症评分以及BALF细胞计数评估炎症细胞在气道周围的浸润情况。采用PAS染色评估支气管杯状细胞增生和气道黏液的分泌情况。收集小鼠肺组织和BALF进行流式细胞仪和ELISA检测 IL-9水平;采用 qRT-PCR 和 Western blot 检测肺组织 FOXO1、IRF4、IL-9 的 mRNA水平和蛋白水平表达情况。结果:1、与对照组比较,OVA哮喘组小鼠的行为学评分明显增加;而气道高表达miR-493-5p后OVA哮喘小鼠的行为学评分与OVA哮喘组相比则明显降低,说明哮喘小鼠气道高表达miR-493-5p对哮喘小鼠的行为学症状能起到缓解的效果。2、OVA哮喘小鼠气道的反应性随着乙酰甲胆碱浓度的增加而逐渐升高,但气道高表达miR-493-5p后气道反应性则降低,这对于改善气道症状是非常有利的,具有保护作用。3、哮喘小鼠气道高表达miR-493-5p后,炎性细胞在气道周围的浸润减少、杯状细胞的增生减轻,气道黏液的分泌减少,同时气道的炎性评分也降低。OVA哮喘小鼠气道转染miR-493-5p agomiR后,BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比和淋巴细胞百分比均较OVA哮喘组降低,提示在OVA哮喘小鼠模型中,miR-493-5p对气道炎症能够起到保护的作用。4、哮喘小鼠气道转染miR-493-5p agomiR后肺组织miR-493-5p的表达水平显著增加,提示miR-493-5p agomiR的转染是成功的,气道高表达miR-493-5p后FOXO1、IRF4和IL-9的mRNA水平及蛋白水平均出现不同程度的降低。5、流式细胞仪检测结果显示哮喘小鼠气道高表达miR-493-5p后肺组织和BALF中IL-9+细胞百分比较哮喘组减低,ELISA结果表明哮喘小鼠气道高表达miR-493-5p后肺组织和BALF中IL-9的表达水平降低。结论:miR-493-5p在OVA哮喘模型中能够抑制Th9细胞分化,减轻气道炎症,miR-493-5p有望作为治疗哮喘的潜在靶点,这为未来哮喘的治疗提供了一定的论证依据。第四部分初步探索DCs分泌的外泌体miR-493-5p对Th9细胞分化的影响目的:从外泌体miRNAs角度出发,初步探索DCs分泌的外泌体miR-493-5p对Th9细胞分化的影响。方法:1、诱导分化OVA哮喘小鼠和对照组小鼠的BMDCs;qRT-PCR检测BMDCs外泌体miR-493-5p的表达水平。2、从WT小鼠骨髓中诱导分化树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）,培养后收集细胞上清,采用超速离心法提取外泌体,并构建Exosome-miR-493-5p NC和Exosome-miR-493-5p inhibitor,转染Naive CD4+T细胞,在Th9诱导分化培养体系中培养,72h后收集细胞,采用流式检测IL-9+细胞百分比。结果:1、OVA哮喘小鼠的DCs外泌体来源的miR-493-5p表达量明显低于对照组。2、在诱导Naive CD4+T细胞向Th9方向分化时,加入DC来源的外泌体可以明显下调IL-9+细胞比例,使用DC外泌体miR-493-5p inhibitor则可以逆转这一改变。结论:DC来源的外泌体miR-493-5p能够抑制Th9细胞的分化。