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背景与目的食管癌是世界范围内常见的消化道肿瘤之一,患者早期无明显症状或症状十分轻微,待出现进行性吞咽困难后就诊,常常已发展到中晚期,失去了手术治疗的最好时机,目前联合化疗是晚期食管癌患者的首选治疗方案。顺铂是临床上应用最广泛的化疗药物之一,但是,许多患者在顺铂治疗过程中出现了化疗抵抗,影响治疗效果。DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)属于DNA聚合酶中的一员,是碱基切除修复(base excision repair,BER)中的关键酶,可填补DNA碱基损伤切除产生的单核苷酸缺口,对于基因组稳定性的维持至关重要。polβ的异常高表达和突变体可引起BER异常、自发突变率增加、基因组不稳定和染色体畸变等,在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。microRNAs(miRNAs)是一类长约18-25个核苷酸的内源性单链非编码RNA,在许多生物体内均有表达,并且高度保守。不同的miRNA在同一细胞中的调控作用不同,靶标分子可能不同,并且同一 miRNA在不同细胞中的靶标分子也可能不同,调控作用也不尽相同。由于miRNAs可调控包括肿瘤相关基因在内的大量基因,因此miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展及治疗预后有着密切关系。本课题组前期通过生物信息学软件分析发现,polβ可能是miR-499的靶基因。前期基因芯片分析结果显示,食管癌患者癌组织中miR-499的表达水平显著低于癌旁组织,并且化疗不敏感食管癌患者癌组织中miR-499的表达水平显著低于化疗敏感组织。通过对实验室保存的具有完整随访记录、组织中polβ已进行过测序的538例食管癌患者资料进行分析,发现177-234 nt缺失型polβ的食管癌患者化疗抵抗,生存期较短。本研究旨在探索miR-499对食管癌细胞化疗敏感性的影响及其作用机制;明晰177-234nt缺失型polβ对食管癌细胞化疗敏感性作用及其机制。本研究共分为以下两部分。第一部分miR-499靶向调控polβ对食管癌细胞化疗敏感性的影响方法1.采用qRT-PCR和Western blot方法检测538例食管癌患者癌组织及其癌旁组织中的polβ和miR-499表达水平;分析食管癌患者癌组织中polβ表达量与miR-499表达量的相关性。2.建立稳定表达miR-499的EC9706和KYSE30细胞株,采用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、免疫荧光和彗星实验方法检测miR-499对食管癌细胞EC9706的KYSE30化疗敏感性的影响。3.建立稳定表达miR-499的EC9706-Luc细胞株,接种到裸鼠右侧腋下。在裸鼠腹腔内按照每千克裸鼠体重3 mg顺铂注射顺铂生理盐水溶液,三天一次,共9次。接种后每7天进行1次裸鼠移植瘤活体成像,观察移植瘤的生长情况。4.利用生物信息学软件分析miR-499的靶基因;构建polβ3’UTR野生型和突变型报告载体,与miR-499 mimic/negative control共转入食管癌细胞EC9706和KYSE30中,进行双荧光素酶报告实验验证polβ是否是miR-499的靶基因。5.构建无polβ 3’UTR的重组表达载体pcDNA3.1-polβ,转入稳定表达miR-499的EC9706和KYSE30细胞株,采用MTT和流式细胞术实验方法检测无3’UTR的polβ对miR-499对食管癌细胞EC9706的KYSE30化疗敏感性影响的回复作用。结果1.食管癌患者癌组织中miR-499的相对表达水平明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);食管癌患者癌组织中polβ mRNA和蛋白的表达水平明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);相关性分析结果显示,食管癌患者癌组织中miR-499与polβ表达量呈负相关。2.细胞学行为实验结果显示,与NC和Blank组相比,miR-499可增强顺铂对EC9706和KYSE30细胞的增殖抑制、凋亡促进作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.裸鼠移植瘤活体成像结果显示,miR-499组裸鼠移植瘤处的绝对光子数自第14天明显低于NC和Blank组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.生物信息学分析结果显示,polβ 3’UTR区包含可与miR-499互补结合的序列,polβ可能是miR-499的作用靶点。双荧光素酶报告实验结果显示,共转染miR-499 mimic和polβ 3’UTR野生型重组载体的细胞中萤光素酶活性明显低于共转染miR-499 mimic和polβ 3’UTR突变型重组载体,和转染miR-499 negative control时的细胞(P<0.05)。5.转染pcDNA3.1-polβ的miR-499组细胞的IC50较单独miR-499组明显升高(P<0.05),凋亡细胞数百分比较单独miR-499组明显降低(P<0.05),无3’UTR的polβ可回复miR-499对食管癌细胞EC9706和KYSE30化疗敏感性的影响。第二部分177-234 nt缺失型polβ对食管癌细胞化疗敏感性的影响方法1.选择本实验室保存的有完整随访资料、组织中Polβ已进行过测序的食管癌患者538例,用Kaplan-Meier方法进行食管癌患者的生存分析。2.建立稳定表达177-234 nt缺失型polβ的EC9706细胞株,采用MTT和流式细胞术方法检测177-234 nt缺失型polβ对食管癌细胞EC9706化疗敏感性的影响。3.将稳定表达177-234 nt缺失型polβ和野生型βolβ的EC9706细胞株接种到裸鼠右侧腋下。按照3 mg/kg(顺铂/裸鼠体重)比例在裸鼠腹腔注射顺铂生理盐水溶液,三天一次。接种4周后处死裸鼠。剥离瘤体组织标本,拍照、称重。4.在链霉亲和素磁珠上偶联生物素标记的177-234 nt缺失型polβ蛋白,与食管癌细胞裂解液孵育,分离结合蛋白后用质谱分析。5.采用BIAcore与pull-down实验验证PIK3IP1是否可与177-234 nt缺失型polβ蛋白结合。6.采用Western blot方法检测稳定表达177-234 nt缺失型polβ对EC9706细胞中PI3K-Akt通路蛋白表达水平的影响。7.采用MTT和流式细胞术方法比较Knock-down PIK3IP1与177-234 nt缺失型polβ对EC9706细胞化疗敏感性的影响。8.在177-234 nt缺失型polβ的EC9706细胞中加入PI3K抑制剂LY294002,采用MTT和流式细胞术方法检测PI3K抑制剂对177-234 nt缺失型polβ影响EC9706化疗敏感性的回复作用。结果1.Kaplan-Meier生存分析结果显示,177-234 nt缺失型polβ患者生存期远差于野生型polp的患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.与野生型polβ细胞相比,177-234 nt缺失型polβ可减弱顺铂/5-FU对EC9706细胞的增殖抑制、增加凋亡促进,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.裸鼠移植瘤实验结果显示,177-234nt缺失型polβ组裸鼠移植瘤体重明显大于野生型裸鼠移植瘤体重(P<0.05),差异具有统计学意义。4.根据质谱结果,分析EC9706细胞中PIK3IP1蛋白可能与177-234nt缺失型polβ蛋白结合。5.BIAcore 与 pull-down 实验结果显示,PIK3IP1 可与 177-234 nt 缺失型 polβ蛋白结合。6.Western blot结果显示,177-234nt缺失型polβ可促进Akt蛋白的磷酸化,从而抑制下游凋亡基因的活化、促进下游增殖基因的活化。7.与βolβ-/-组相比,PIK3IP1 siRNA和177-234 nt缺失型polβ组细胞中顺铂/5-FU的增殖抑制能力和凋亡促进作用均减弱,差异具有统计学意义(P<0.05),而PIK3IP1 siRNA和177-234nt缺失型polβ组间没有明显统计学差异(P>0.05)。8.MTT和流式细胞术实验结果显示,PI3K抑制剂LY294002可通过抑制PI3K活化,增强顺铂/5-FU对EC9706细胞的增殖抑制和凋亡促进,部分回复177-234 nt缺失型polβ对EC9706细胞化疗敏感性的作用。结论1.miR-499通过靶向polβ 3’UTR调控polβ表达水平,增强顺铂对EC9706和KYSE30细胞的增殖抑制和凋亡促进作用,提高食管癌细胞的化疗敏感性。2.177-234 nt缺失型polβ蛋白可通过结合PIK3IP1蛋白激活PI3K通路,减弱顺铂/5-FU对EC9706细胞的增殖抑制和凋亡促进作用,降低食管癌细胞的化疗敏感性。