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研究背景胰腺癌是高度致命的恶性肿瘤之一。患者起病隐匿通常被发现时已经处于晚期。晚期胰腺癌患者已经失去手术完全切除的机会,需要辅助化学治疗及放射治疗。胰腺癌对于辐射不敏感,所以晚期胰腺癌患者常常因缺乏有效的治疗手段导致总体预后不良。课题组以往研究发现,肿瘤周围脂肪组织与消化道肿瘤的恶性表型密切相关。胰腺位于腹膜后富含脂肪的解剖位置,且肥胖与该疾病的发生有关;然而,胰腺癌的辐射抗性是否与腹腔脂肪之间存在相互作用有关,目前尚不明确。研究目的本课题旨在明确脂肪细胞对胰腺癌辐射敏感性的作用、探索其中所涉及的调控机制,并开发一种可能用于胰腺癌辐射增敏的新策略。研究方法（一）脂肪细胞可降低胰腺癌的辐射敏感性:1、获取人胰腺癌组织标本进行HE染色分析胰腺癌组织周围脂肪细胞分布;2、获取人腹腔脂肪组织,使用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织分离出成熟的游离脂肪细胞;3、建立脂肪细胞与胰腺癌共培养模型,并采用克隆形成实验观察胰腺癌细胞照射后细胞存活能力;4、彗星实验、γ-H2AX免疫荧光检测电离辐射后胰腺癌细胞DNA损伤情况;5、细胞周期、细胞凋亡等实验检测脂肪细胞对受照胰腺癌细胞的周期检查点激活、凋亡程序激活的影响;6、线粒体特异性荧光探针检测电离辐射照射后,脂肪细胞对胰腺癌细胞内重要细胞器的保护作用;（二）脂肪细胞来源的脂肪酸结合蛋白4（FABP4）介导脂肪细胞对胰腺癌辐射敏感性的调控作用:1、Seahorse细胞能量代谢分析仪检测脂肪细胞共培养后人胰腺癌细胞能量代谢的改变。2、BODIPY染色及免疫荧光检测共培养体系中人胰腺癌细胞内脂肪酸以及脂肪酸结合蛋白含量是否改变。3、CRISPR/Cas9技术构建缺失FABP4的脂肪前体细胞（3T3-L1）,并使用诱导分化液Ⅰ、Ⅱ诱导脂肪前体细胞分化为成熟脂肪细胞;4、建立3T3-L1与胰腺癌细胞共培养模型,细胞周期、细胞凋亡等实验;5、合成人重组FABP4蛋白,采用彗星实验、γ-H2AX免疫荧光、细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电位实验检测FABP4对人胰腺癌细胞辐射敏感性的影响;（三）FABP4-eIF3a信号途径可能是脂肪细胞干预胰腺癌细胞放射敏感性的关键调控机制:1、实时定量PCR法检测外源性FABP4进入到胰腺癌细胞是否会影响内源性FABP4基因转录水平;2、FABP4单克隆抗体对照射后胰腺癌细胞进行免疫共沉淀,采用多维蛋白质鉴定技术和2D液相色谱串联质谱对下拉蛋白进行分析;3、采用免疫共沉淀联合免疫印迹实验检测人胰腺癌细胞内FABP4与eIF3a是否存在相互作用;4、eIF3a的小干扰RNA沉默人胰腺癌细胞eIF3a联合细胞凋亡等实验方法探究eIF3a对胰腺癌辐射敏感性的影响;5、RNA结合蛋白免疫沉淀实验联合实时定量PCR探究FABP4对eIF3a结合辐射损伤修复相关RNA的影响;6、eIF3a的小干扰RNA沉默人胰腺癌细胞eIF3a后联合免疫印迹实验观察eIF3a对胰腺癌细胞DNA损伤修复蛋白表达的影响;7、免疫印迹实验检测人重组FABP4及脂肪细胞处理人胰腺癌细胞后DNA损伤修复蛋白表达的影响（四）脂肪细胞外泌体来源的miRNA可能是脂肪细胞调控胰腺癌放射敏感性的又一潜在机制:1、外泌体抽提试剂盒提取脂肪细胞来源的外泌体,采用细胞周期、细胞凋亡等指标检测脂肪细胞来源的外泌体对受照的胰腺癌细胞周期阻滞、细胞凋亡的影响;2、采用脂肪细胞来源的外泌体,进行small RNA测序,获取的差异miRNAs根据差异倍数与表达值,筛选miRNAs;3、通过搜库,对其可能的靶基因进行GO和KEGG预测;从预测条目中,确定与辐射损伤修复有关的通路相关基因;4、构建miRNA引物,在与脂肪细胞共培养的胰腺癌细胞中验证筛选出miRNA的表达;5、通过数据库预测筛选出miRNA的靶基因;5、构建hsa-miRNA-199b-5p的mimics及inhibitor,采用qPCR检测靶基因被调控情况。研究结果（一）脂肪细胞可降低胰腺癌的辐射敏感性:1、与脂肪细胞共培养的胰腺癌细胞在电离辐射后存活比例上升;2、单细胞凝胶电泳、γ-H2AX免疫荧光实验结果显示脂肪细胞可减少胰腺癌细胞由电离辐射引起的DNA损伤;3、细胞周期、细胞凋亡等实验结果显示脂肪细胞可以减少胰腺癌细胞内由电离辐射引起的周期阻滞和细胞凋亡;4、线粒体膜电位实验显示:脂肪细胞可稳定胰腺癌细胞内由电离辐射引起的线粒体膜电位变化;（二）脂肪细胞来源的脂肪酸结合蛋白4介导脂肪细胞对胰腺癌辐射敏感性的调控作用:1、Seahorse细胞能量代谢结果显示:与脂肪细胞共培养联合电离辐射处理的胰腺癌细胞代谢水平升高;2、BODIPY染色及免疫荧光检测结果显示,共培养体系中的胰腺癌细胞内脂质及脂肪酸结合蛋白含量增加;3、免疫印迹结果显示通过CRISPR/Cas9技术删除FABP4基因的3T3-L1细胞内基本没有FABP4的表达;2、油红O染色结果显示FABP4基因不影响3T3-L1的分化成熟;3、细胞周期及细胞凋亡结果显示:脂肪细胞在敲除FABP4后对胰腺癌细胞周期、凋亡的影响被反转;4、彗星实验、γ-H2AX免疫荧光检测结果显示外源性FABP4可降低胰腺癌辐射敏感性;（三）FABP4-eIF3a信号途径可能是脂肪细胞干预胰腺癌细胞放射敏感性的关键调控机制:1、qPCR检测发现外源性FABP4可促进胰腺癌细胞内FABP4基因的转录和翻译;5、免疫共沉淀联合多维蛋白质鉴定技术和2D液相色谱串联质谱结果显示电离辐射后有142种蛋白与FABP4互作,其中结合肽段最长的为eIF3a蛋白;6、免疫共沉淀联合免疫印迹实验证实人胰腺癌细胞中FABP4与eIF3a存在相互作用;7、细胞凋亡实验结果显示:沉默eIF3a后电离辐射引起的胰腺癌凋亡率下降;7、RIP实验结果显示:电离辐射联合FABP4处理的胰腺癌细胞内eIF3a与DNA双链断裂非同源末端修复途径相关基因结合增加;8、免疫印迹实验结果显示eIF3a抑制非同源末端修复途径中KU80及Mre11蛋白的表达,FABP4及脂肪细胞处理后胰腺癌细胞内KU80及Mre11蛋白表达增加;（四）脂肪细胞外泌体来源的miRNA可能是脂肪细胞调控胰腺癌放射敏感性的又一潜在机制:1、细胞周期及细胞凋亡实验结果显示:脂肪细胞来源外泌可降低胰腺癌由电离辐射诱导的细胞凋亡并且激活细胞周期检查点;2、Small RNA测序检测到的差异miRNA 330个;3,预测靶基因进行GO和KEGG分析发现在20种上调的miRNA中14种靶基因功能与辐射损伤相关;4、RT-PCR实验结果表明:hsa-miRNA-199b-5p在与脂肪细胞共培养的胰腺癌细胞中含量升高,增高趋势在照射后进一步加强;5、数据库预测结果发现CCNL1、JAG、NLK、TAF9B、HIF1A 等基因可能为 hsa-miRNA-199b-5p 的靶基因;6、Mimics联合实时定量PCR结果显示hsa-miRNA-199b-5p下调靶基因转录。研究结论（1）脂肪细胞可引起胰腺癌细胞辐射抵抗;（2）脂肪细胞通过分泌FABP4影响胰腺癌辐射敏感性;（3）FABP4-eIF3a信号途径通过干预NHEJ修复蛋白的表达调控胰腺癌细胞辐射敏感性;（4）脂肪细胞外泌体来源的miRNA可能是脂肪细胞调控胰腺癌放射敏感性的又一潜在机制。