血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫感染引起的一种热带及亚热带人兽共患病,主要流行于中东、南美、东南亚,特别是撒哈拉以南的非洲地区。我国主要流行的是日本血吸虫病（Schistosomiasisjaponica）,该病传播依靠中间宿主钉螺逸出感染阶段尾蚴,经皮肤侵入人体发育为童虫,童虫经移行最终至肝门-肠系膜静脉系统发育为成虫并合抱产卵。虫卵沉积于肝脏组织并形成大量虫卵肉芽肿,晚期虫卵肉芽肿逐渐被纤维组织替代导致肝纤维,严重影响患者的劳动能力和生活质量。由于缺乏有效疫苗,血吸虫病防治目前主要依赖于药物化疗。吡喹酮（Praziquantel,PZQ）自问世以来,因其具有低毒、高效、广谱等优点被WTO推荐为治疗血吸虫病的首选药物。但长期、大量、反复应用单一药物治疗,使PZQ耐药性成为全球关注的热点问题。目前,已有研究报道证实在实验室条件下能够诱导出PZQ抗性虫体,面临床上亦已报道了 PZQ治疗不敏感的病例。此外,PZQ对童虫效果不佳,且不能预防再感染,因此对生活在血吸虫病流行区多次重复感染（成虫和童虫并存）病例PZQ治疗效果较差,易出现治疗失败的情况,因此研发能够替代或辅助PZQ的新型抗血吸虫药物势在必行。本课题组在前期实验研究中,通过联合PZQ及青蒿琥酯药效基团合成了新型PZQ衍生物DW-3-15（专利号:ZL201110142538.2）,并证实经商品化合成的DW-3-15亦具有良好的体内外抗成虫及童虫效果,且TMT（Tandem mass tags labeling proteome quantification）测定分析结果表明,经DW-3-15作用后的虫体蛋白组分显示其杀虫机制可能与抑制虫体乙酰转移酶（SjHAT）有关,其作用靶点可能与PZQ存在差异。基于前期工作,本研究应用PZQ联合DW-3-15,观察其体内外抗日本血吸虫生物学效应,探讨PZQ与DW-3-15联合应用是否具有协同作用,并观察两种化合物对成虫及童虫SjHAT转录及表达的影响,深入探讨两种化合物抗日本血吸虫的潜在靶点及作用机制,为探索其联合化疗作为潜在的抗血吸虫新方案提供科学依据。一、吡喹酮及其衍生物DW-3-15体外联合应用对日本血吸虫的杀伤作用目的探讨PZQ联合DW-3-15体外对日本血吸虫不同发育阶段的杀伤效应。方法日本血吸虫尾蚴经皮肤感染ICR小鼠,分别于感染后14 d及35 d采用肝门静脉灌注法收集童虫和（雌、雄）成虫。虫体样本置于完全培养基中,空白对照组虫体加入0.1%DMSO,单一用药组分别加入终浓度为25～100 μM的PZQ或DW-3-15,联合用药组加入PDa（50μM PZQ联合50μM DW-3-15）以及PDb（100μM PZQ联合100μM DW-3-15）。各组化合物分别作用于童虫和成虫,培养16 h后换液,置于不含药物的完全DMEM培养基中培养至72 h,期间每天观察并统计虫体活力和虫体存活率,应用碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色观察虫体组织死亡程度。培养结束后,计算药物协同指数,收集雄虫,并在扫描电镜下观察虫体体表超微结构变化。结果1.体外实验显示:在单一用药组中,PZQ与DW-3-15抗虫效果具有剂量依赖效应,在100 μM时效果最佳,72 h成虫活力降低率分别为67.8%～72.3%及94.3%～94.4%,童虫分别为68.9%及97.8%。联合用药组PDa及PDb均有良好抗虫效果,与对照组相比活力分值具有显著性差异（P＜0.0001）。培养72 h后,高剂量联合用药组PDb可杀死全部雄虫及童虫,雌虫活力降低率可达99.0%;低剂量联合用药组PDa可致童虫活力降低至100%,雄虫及雌虫活力降低率至93.3%～94.4%,其抗成虫效应与100 μM DW-3-15相近且优于100 μM PZQ。联合用药组抗童虫、雄虫及雌虫协同指数分别为0.28～0.57、0.27～0.63及0.53～0.65,表明PZQ与DW-3-15联合应用具有协同效应。此外,PI染色结果显示,联合用药组成虫及童虫荧光信号强于单一用药组,表明联合用药组虫体组织受损程度高于单一用药组。2.形态观察显示:当100μM PZQ作用成虫及童虫72 h后,虫体可出现痉挛性麻痹、呈螺旋型蜷缩,体态僵硬,而100μM DW-3-15作用于虫体培养至72h,虫体则出现明显的肿胀,成虫收缩变短并蜷缩,童虫僵直如棒状或出现轻微蜷缩。当药物联合作用时,PDa与PDb作用后虫体体态僵硬伴有轻微肿胀,成虫呈U型或O型蜷缩,童虫呈直棒状或轻微蜷缩,体表出现空泡状改变,仅虫体头端呈微弱运动。3.电镜结果显示:与空白对照组和DW-3-15、PZQ单一用药组相比,联合用药组PDa及 PDb则可诱导虫体体表出现严重损伤,虫体表皮大面积剥脱裸露皮下肌层,伴有肌层组织损伤及溶解,同时口吸盘肌层表面出现坑状损伤,腹吸盘组织广泛崩解,肿胀塌陷,表面形成长而不规则的裂隙。结论PZQ与DW-3-15联合用药,在体外对日本血吸虫成虫和童虫均具有显著的杀伤作用,其效果优于单一药物,具有协同增效作用。二、吡喹酮及其衍生物DW-3-15体内联合应用抗日本血吸虫生物学效应目的探讨PZQ联合DW-3-15体内对日本血吸虫不同发育阶段虫体的杀伤效应及对虫卵肉芽肿形成的影响。方法建立日本血吸虫感染小鼠模型,分别于感染后14 d（童虫阶段）、21 d（童虫及成虫混合感染阶段）和28 d（成虫阶段）灌胃给药,空白对照组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,单一用药组给予100～400 mg/kg PZQ或DW-3-15,低剂量联合用药组给予PDc（100 mg/kg PZQ联合400 mg/kg DW-3-15）,高剂量联合用药组给予PDd（200 mg/kg PZQ联合400 mg/kg DW-3-15）,连续给药5d,于治疗结束后21 d解剖小鼠,统计各组减虫率、减卵率、协同指数及虫卵肉芽肿面积。结果1.单一用药组:经PZQ或DW-3-15单独治疗后,小鼠体内虫荷和虫卵数呈药物剂量依赖效应。PZQ治疗小鼠体内成虫后,最高减虫率（96.9%）及减卵率（85.2%）高于DW-3-15治疗组（减虫率60.0%和减卵率78.0%）。PZQ治疗小鼠体内童虫后,减虫率（43.3%）和减卵率（83.2%）均低于同剂量DW-3-15治疗组（减虫率70.3%和减卵率84.7%）。在治疗感染混合虫期小鼠模型时,DW-3-15处理组的减虫率（74.5%）高于PZQ处理组（64.1%）,而DW-3-15处理组减卵率（74.5%）则与PZQ处理组减卵率相似（79.4%）。2.联合药物治疗:联合用药组亦具有药物剂量依赖效应,高剂量联合用药组（PDd）治疗效果优于低剂量联用药组（PDc）。经过PDd治疗,感染后14 d、21 d及28 d小鼠体内减虫率分别可达83.8%、83.0%和97.3%。此外,PDc抗14 d童虫和21 d混合感染虫体效果与400 mg/kg DW-3-15治疗组相似,优于200 mg/kg PZQ治疗组;而其治疗小鼠体内28 d成虫时,效果与200 mg/kg PZQ治疗组相似,并优于400 mg/kg DW-3-15治疗组,表明低剂量药物联合治疗仍可达到甚至优于单一药物的治疗效果。在减卵率方面,药物联合治疗效果同样优于单一药物,分别在小鼠感染后14 d、21 d及28 d给药,PDd组减卵率分别高达99.6%、94.1%和87.3%。当剂量减半后,PDc组减卵率仍分别可达96.5%、86.0%和81.4%。同时,联合用药组治疗感染后14 d、21 d及28 d小鼠,其药物协同指数分别为0.49～0.63、0.59～0.94及0.43～0.46,表明PZQ与DW-3-15联合具有协同增效作用。3.肝脏病理:低剂量与高剂量联合用药组分别治疗感染后14 d、21 d以及28 d小鼠,虫卵肉芽肿面积与对照组相比均有显著性差异（P＜0.01;P＜0.001）,联合药物治疗后肝脏肉芽肿面积明显减小,炎性细胞浸润程度减轻,优于单一用药组。结论在体内实验中,PZQ联合DW-3-15对感染14 d童虫、21d童虫与成虫混合及28 d成虫的小鼠均有显著的治疗效果,具有协同增效作用,在降低虫荷及虫卵数量的同时,可减小虫卵肉芽肿面积,缓解肝脏病变,结果表明,PZQ与DW-3-15联合化疗具有作为新型抗血吸虫病疗法的潜在价值。三、DW-3-15影响日本血吸虫SjHAT转录和表达目的研究体内外不同浓度DW-3-15对日本血吸虫成虫及童虫HAT转录及表达水平的影响,为探讨DW-3-15抗日本血吸虫的作用机制提供依据。方法1.体外实验:日本血吸虫尾蚴感染小鼠14 d和35 d后,体外实验部分采用肝门静脉灌注法收集童虫及成虫,25～100 μM PZQ或25～100 μM DW-3-15作用于虫体16 h,对照组虫体置于含0.1%DMSO的完全培养基中,之后更换不含药物的培养基连续培养72 h,收取样本,提取虫体RNA及总蛋白,用实时荧光定量PCR及Western blotting检测各组虫体SjHAT的转录及表达水平。2.体内实验:日本血吸虫尾蚴感染小鼠14 d和35 d后,给予实验组小鼠100～400 mg/kg DW-3-15或100～400 mg/kg PZQ灌胃治疗,对照组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠灌胃治疗,连续用药2d。治疗后2d经肝门静脉灌注法收集成虫及童虫,提取虫体RNA及总蛋白。应用实时荧光定量PCR及Western blotting技术,检测各用药组虫体SjHAT转录及表达水平。结果在体外实验中,实时荧光定量PCR结果显示,经不同浓度DW-3-15、PZQ体外作用后,日本血吸虫雄虫、雌虫及童虫SjHAT转录水平随药物剂量增加而下降,并出现显著下调趋势（P＜0.0001）,且经50 μM、75 μM和100 μM DW-3-15处理后的雌虫SjHAT转录水平显著低于相同浓度的PZQ处理组（P＜0.0001）。经DW-3-15和PZQ处理后,雄虫、雌虫及童虫SjHAT表达水平与转录水平变化一致,除25 μM PZQ组童虫SjHAT上调表达外,其余DW-3-15与PZQ用药组SjHAT均下调表达,以100 μM处理组下调最为明显,雌虫与童虫SjHAT表达水平与正常对照组相比具有显著性差异（P＜0.0001）。在体内实验中,小鼠经100～400 mg/kgDW-3-15治疗后,其体内雄虫SjHAT转录水平较正常对照组呈先升后降的趋势,在100 mg/kg剂量下呈转录上调（P＜0.001）,在 400mg/kg剂量下呈转录下调（P＜0.05）。100～400 mg/kg DW-3-15组雌虫SjHAT转录水平均出现显著下调（P＜0.05;P＜0.0001）,且具有剂量依赖效应。童虫SjHAT转录水平随DW-3-15剂量增加而下降,但与对照组相比均呈显著上调趋势（P＜0.05;P＜0.0001）。小鼠经100～400 mg/kgPZQ治疗后,体内雄虫SjHAT转录水平均高于正常对照组（P＜0.001;P＜0.0001）,随药物剂量增加而不断下降;雌虫SjHAT转录水平呈现先降后升的趋势,在100 mg/kg与200 mg/kg剂量下,雌虫SjHAT转录水平出现显著下调（P＜0.0001）,当剂量升至400mg/kg时,雌虫SjHAT转录水平升高,但仍低于正常对照组（P＜0.01）。童虫SjHAT转录水平随DW-3-15剂量增加而不断下降,但与对照组相比呈显著上调趋势（P＜0.05;P＜0.0001）。而PZQ组童虫SjHAT转录水平随药物剂量增加而不断升高,100 mg/kg PZQ处理组童虫SjHAT出现显著下调（P＜0.05）,而200 mg/kg与400 mg/kg PZQ处理组童虫SjHAT则呈显著上调趋势（P＜0.001;P＜0.0001）。在蛋白表达方面,不同剂量DW-3-15治疗感染后35 d小鼠,可下调其体内雄虫及雌虫SjHAT表达,在400 mg/kg时下调最为显著（P＜0.0001）。而相同剂量PZQ治疗后,小鼠体内雄虫SjHAT表达水平随PZQ剂量增加而下降,但均呈显著上调表达（P＜0.0001）;各PZQ治疗组雌虫SjHAT表达水平均低于对照组,但无药物剂量依赖效应。此外,童虫SjHAT表达水平随DW-3-15剂量增加而升高,剂量为200 mg/kg与400mg/kg时虫体SjHAT显著上调（P＜0.05;P＜0.001）。而经100～400mg/kg PZQ治疗后,童虫SjHAT蛋白表达水平随PZQ剂量增加逐渐降低,但呈显著上调表达（P＜0.0001）。结论研究结果表明DW-3-15与PZQ均可影响成虫及童虫SjHAT转录和表达水平,且两种药物对于SjHAT的转录和表达影响不同,进一步表明两种药物体内外抗成虫及童虫作用的靶点和机制可能存在差异,为阐明DW-3-15及PZQ抗日本血吸虫作用机制提供了新的实验依据。四、DW-3-15对日本血吸虫组蛋白乙酰化水平的影响目的研究体内外DW-3-15对日本血吸虫成虫及童虫组蛋白H3、H4乙酰化水平影响,为深入探讨与组蛋白相关的DW-3-15抗虫作用机制提供实验数据。方法1.体外实验:日本血吸虫尾蚴感染小鼠14 d和35 d后,采用肝门静脉灌注法收集童虫及成虫,100 μM PZQ或100μM DW-3-15作用于虫体16 h,之后更换不含药物的培养基连续培养72 h,收取样本,提取虫体总蛋白,Western blotting检测组蛋白H3及H4乙酰化水平。2.体内实验:在小鼠感染日本血吸虫尾蚴后14 d和35 d,给予实验小鼠400mg/kg DW-3-15或400 mg/kg PZQ灌胃治疗,对照组则采用0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,各组连续灌胃2d后停药,待停药2d进行肝门静脉灌注收取虫体样本,提取虫体总蛋白,Western blotting检测各组虫体H3及H4乙酰化水平。结果1.在体外实验中,DW-3-15与PZQ作用后雄虫及雌虫H4乙酰化水平均呈现显著的下调趋势（P＜0.001;P＜0.0001）,而雄虫H3乙酰化水平则无明显变化;DW-3-15组雌虫H3乙酰化水平显著上调（P＜0.01）,PZQ组雌虫H3乙酰化水平则显著下调（P＜0.05）。相同条件,DW-3-15与PZQ均可使童虫H3及H4乙酰化水平下调,除DW-3-15组H3乙酰化水平与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）,其余各组与正常对照组虫体相比均具有显著性差异（P＜0.001;P＜0.0001）。2.在体内实验中,DW-3-15组雄虫及雌虫H4乙酰化水平显著下调（P＜0.01;P＜0.0001）,而H3乙酰化程度则出现相反趋势（P＞0.05）;PZQ组雄虫及雌虫H4乙酰化表达水平均显著下调（P＜0.01;P＜0.0001）,而PZQ组雌虫H3乙酰化水平显著上调（P＜0.0001）,雄虫H3乙酰化水平则呈显著下调（P＜0.01）。对于14d童虫,DW-3-15可使虫体H3及H4乙酰化程度增强（P＜0.01;P＜0.001）,而PZQ则使童虫H3乙酰化水平下调（P＜0.001）,H4乙酰化水平出现上调（P＜0.01）。结论DW-3-15与PZQ可影响成虫及童虫H3以及H4乙酰化水平,且对H4的乙酰化影响更为显著,结合第三部分实验结果,推断SjHAT下调可能直接抑制成虫组蛋白H4乙酰化,发挥杀虫作用,而童虫与成虫H4乙酰化水平变化不一致,提示两种化合物抗成虫及童虫作用靶点和机制可能存在差异。本部分实验为进一步阐明DW-3-15及PZQ与组蛋白乙酰化相关的抗虫作用机制提供了新的实验数据。综上,PZQ联合DW-3-15具有协同增效作用,在体外、内兼有抗日本血吸虫童虫和成虫生物学活性,并可抑制肝脏纤维化,效果优于单一用药。应用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测经不同浓度DW-3-15及PZQ处理后日本血吸虫成虫和童虫SjHAT在体内外转录及表达的动态变化,结果显示两种药物对不同发育阶段虫体SjHAT的转录水平和表达水平影响不同,且可影响H3与H4乙酰化水平,进一步提示SjHAT可能是DW-3-15及PZQ抗血吸虫作用的潜在靶点,且两种药物影响SjHAT的作用机制可能存在差异,为进一步明确抗血吸虫药物靶点及作用机制以及制定血吸虫病临床用药新方案提供了科学依据。