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目的:p53(35)E4p基因是一个从人白血病T细胞Jurkat中获得的抑癌基因p53的新剪接变体。本研究分析其碱基序列及探索其是否表达蛋白产物;并通过构建重组真核表达载体p IRES2-p53(35)E4p进行HEK-293T细胞转染实验,观察p53(35)E4p基因的强制表达是否会对HEK-293T细胞产生影响。为进一步研究p53(35)E4p基因奠定基础,并为深入了解TP53基因的生物学功能提供新方向,望能为肿瘤的诊断、预后以及治疗提供一定的指导意义。方法:一、为了探究Jurkat细胞中p53基因的突变情况,对Jurkat细胞的p53基因的CDS区进行特异性扩增,其后对扩增产物进行Sanger测序,从测序结果中意外发现了p53新剪接体p53(35)E4p基因的存在。根据测序结果,对p53(35)E4p基因进行序列分析并运用Western Blot法检测Jurkat细胞中p53(35)E4p基因的表达产物;二、构建重组真核表达载体pIRES2-p53(35)E4p,运用磷酸钙转染法将pIRES2-p53(35)E4p质粒导入HEK-293T细胞中,Western Blot和免疫荧光实验检测p53(35)E4p基因或p53蛋白在HEK-293T细胞中的表达情况;三、将p IRES2-p53(35)E4p质粒导入HEK-293T细胞后,运用MTT,PI染色以及细胞周期实验,检测p53(35)E4p的强制表达对HEK-293T细胞的增殖、死亡率和细胞周期的影响;四、磷酸钙及脂质体转染p53(35)E4p进入HEK-293T后,观察外源报告基因EGFP(增强绿色荧光蛋白)的表达差异,并使用流式细胞术对EGFP的荧光强度、平均荧光强度(MFI)和转染效率进行考察;五、将两种转染方法处理后的HEK-293T细胞进行转录组学分析,初步探究导致两种转染方法中外源报告基因EGFP表达差异的原因。结果:在这项研究中,我们从人类白血病T细胞系Jurkat中鉴定出一个新的TP53剪接变体,由于该剪接变体在TP53基因的第四外显子处缺少了200个核苷酸,我们将其命名为p53(35)E4p基因。为了进一步了解p53(35)E4p的生物学功能,我们进行了表达分析和转染实验。Western Blot未检测到p53(35)E4p的蛋白产物,但其能增强某个与抗p53抗体结合的约25kDa的蛋白的表达水平;在表达野生型p53蛋白的HEK-293T细胞中强制表达p53(35)E4p可抑制细胞增殖,促进细胞死亡。有趣的是,p53(35)E4p显著增强了h-CMV启动子下游EGFP的表达。转录组分析表明,磷酸钙法转染p53(35)E4p的细胞中,与“DNA结合和RNA聚合酶II对转录的调控”功能相关的基因表达上调,大量未注释的基因或者假基因的表达也发生了变化,提示p53(35)E4p可能影响细胞代谢和调节基因表达。而造成脂质体转染p53(35)E4p后EGFP的表达差异,我们推测是脂质体通过诱导细胞内无义介导的mRNA衰变(NMD)的发生,使得部分p53(35)E4p基因的mRNA被分解代谢,抑制了p53(35)E4p基因促进外源报告基因EGFP表达的功能,从而造成了脂质体转染组的荧光强度差别无磷酸钙转染组明显的现象。结论:1.p53(35)E4p基因是一个新的TP53剪接变体,其在TP53基因的第四外显子处缺少了200个核苷酸,我们将其命名为p53(35)E4p基因;2.p53(35)E4p基因无蛋白产物,但能增强某个与抗p53抗体结合的蛋白的表达水平;3.p53(35)E4p基因可能通过诱导G1期阻滞和细胞死亡而影响HEK-293T细胞的增殖;4.p53(35)E4p基因转染可增强外源报告基因EGFP的表达;5.p53(35)E4p影响HEK-293T细胞中的基因表达,提示p53(35)E4p可能影响细胞代谢和调节基因表达;6.脂质体可能通过诱导细胞内NMD的发生,抑制了p53(35)E4p基因促进外源报告基因EGFP表达的功能。