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目的探讨补肾复方治疗帕金森病(Parkinson Disease, PD)的抗氧化作用机制,观察其对H2O2氧化损伤后MES23.5多巴胺能神经细胞抗氧化酶的影响,为补肾复方的临床应用提供一定的理论依据。方法MES23.5多巴胺能神经细胞分为正常组(新鲜培养液)、H2O2组(H2O2培养液)、银杏叶组(H2O2+银杏叶提取物培养液)、补肾复方低、中、高剂量组(H2O2+不同剂量补肾复方培养液)。即取对数生长期的MES23.5神经细胞接种在铺有多聚赖氨酸的6孔板/96孔培养1天后,正常组更换新鲜培养液,H2O2组、银杏叶组、补肾复方低、中、高剂量组更换150μ mol/L含H2O2培养液,干预12h；H2O2干预结束后,正常组、H2O2组更换新鲜培养液,银杏叶组、补肾复方低、中、高剂量组更换终浓度12.5、3.125、6.25、12.5μg/ml含药培养液,干预24h；MTT法检测各组细胞存活率；光镜观察各组细胞形态的变化；电镜观察各组细胞超微结构；ELISA法测定各组细胞内抗氧化酶活性；Western blot检测HO-1,CAT, GPx-1蛋白表达；RT-PCR检测HO-1、CAT、GPx-1基因表达情况。结果1.细胞存活率的变化1.1不同时间和浓度的H2O2对细胞存活率的影响H2O2浓度在150-500μ mol/L内细胞存活率呈剂量、时间依赖。150μmol/L H2O2干预12h后细胞的存活率已降低为52.81%,干预24h后细胞的存活率已降低为50.61%,干预48h后细胞的存活率已降低为25.35%。因此,150μmol/LH2O2干预12h作为实验的干预条件。1.2不同时间和浓度的补肾复方对细胞存活率的影响单独加入补肾复方(最大浓度到100μ g/ml)均对细胞无毒性作用。1.3补肾复方改善H2O2损伤的细胞存活率150μ mol/L H2O2干预12h后细胞的存活率已降低为46.76%。12.5μ g/ml银杏叶干预24h后细胞的存活率恢复为71.781%。补肾复方改善H2O2诱导的细胞存活率下降,且呈剂量依赖趋势。3.125μ g/ml、6.25μ g/ml、12.5μ g/ml补肾复方干预24h,细胞存活率分别为95.86%,96.49%and99.04%。2.细胞结构变化2.1细胞形态变化正常组细胞呈神经元突起形态,H2O2组处理后神经细胞出现明显的减少,细胞变圆和退化形态(皱缩,突起出现气泡)。但是,银杏叶或补肾复方处理后神经细胞增多,细胞形态改善,较H2O2组细胞皱缩少。2.2细胞超微结构变化正常组,细胞不规则形,膜未见破裂,微绒毛样突起多、不规则；核近居中大而椭圆；常染色质多,异染色质散在；线粒体呈短棒状或卵圆形,散在,可见较多嵴。H2O2组细胞呈典型氧化损伤现象,椭圆形,微绒毛样突起明显减少；核多见变小,呈肾形；受损线粒体多见,呈肿胀,可见嵴断裂或消失；粗面内质网明显脱颗粒。补肾复方改善H202诱导氧化损伤现象,细胞表面可见微绒毛样突起；不同剂量组线粒体可见较多嵴,尤其高剂量组；粗面内质网未见明显脱颗粒。3.抗氧化酶的变化3.1细胞内SOR、CAT、GPx-1、GSH的变化与正常组比较,H2O2组细胞中SOR含量显著增多,HO-1、CAT、GPx-1、GSH的活力均有显著下降；银杏叶组和补肾复方各组细胞中SOR含量减少,HO-1、CAT、GPx-1、GSH的活力均提高,且高剂量组较为明显。3.2HO-1、CAT、GPx1蛋白表达的变化与正常组比较,H2O2组细胞中HO-1、CAT、GPx-1表达明显下调；银杏叶组和补肾复方各组HO-1、CAT、GPx-1表达上调,且高剂量组最为明显。3.3HO-1、CAT、GPx-1基因表达的变化与正常组比较,H2O2组细胞HO-1、CAT、GPx-1基因表达水平显著下降；银杏叶组和补肾复方各组HO-1、CAT、GPx-1基因表达水平上调,且高剂量组最为明显。结论1.补肾复方上调MES23.5神经细胞氧化损伤后抗氧化酶的水平,发挥抗氧化应激作用是补肾复方改善帕金森病症状的作用机制之-2.本实验为补肾复方作为改善氧化应激损伤引起的帕金森病临床用药提供了一定实验依据。