甘蓝型油菜BnTFL1基因克隆及其功能分析

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油菜(Brassica napus L.)是我国的主要油料作物之一。油菜的无限花序导致单株油菜角果成熟期不一致而不利于机械化收获,从而影响了农民种植油菜的积极性。拟南芥TERMINAL FLOWER1(TFL1)基因是花序发育和开花时间的关键调控因子,目前已在大部分物种中克隆到TFL1同源基因,并证实这些TFL1同源基因可以调控花序发育和开花时间。本研究以甘蓝型油菜K407为材料,通过分子进化树分析和同源基因序列比对,在油菜中获得TFL1的同源基因,将其命名为Bn TFL1,并通过生物信息学分析、亚细胞定位、转基因等手段初步验证了其功能,主要研究结果如下:(1)生物信息学分析结果表明,Bn TFL1与TFL1同属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族,共有178个氨基酸,是一个相对不稳定的亲水性蛋白。Bn TFL1蛋白含有23个磷酸化位点,2个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点,但不存在信号肽和跨膜结构。亚细胞定位预测结果表明,Bn TFL1可能定位于细胞质,其蛋白二级结构和三级结构与拟南芥At TFL1一致,表明Bn TFL1为At TFL1的同源基因。(2)基因表达谱分析表明,油菜TFL1同源基因在各个组织中的表达模式不一致,说明这些基因在油菜中的功能有分化。其中Bn TFL1基因主要在茎尖,叶片,幼嫩的角果和种子中表达。(3)构建了p K7FWG2.0-Bn TFL1载体进行洋葱表皮细胞的瞬时转化,荧光信号表明Bn TFL1蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞质和细胞核中。进一步利用甘蓝型油菜下胚轴遗传转化体系获得了稳定表达的Bn TFL1-e GFP融合转基因植株,发现荧光信号同样定位于幼根原生质体的细胞质和细胞核中,与洋葱表皮瞬时转化的结果基本一致,表明Bn TFL1蛋白定位于细胞质和细胞核中。(4)过表达Bn TFL1转基因植株的表型分析结果表明,过表达植株的主茎和分枝的下半部分角果均表现出不育的性状。与野生型相比(结实率为82.6%),过表达Bn TFL1的转基因植株的结实率普遍较低,转基因株系最高结实率为55.5%、最低结实率仅有34.9%,并且Bn TFL1的表达量越高,其结实率越低。由此我们推测,过量表达Bn TFL1可能使部分雌蕊不育,导致角果中的胚珠不发育,从而降低结实率。(5)为了进一步验证Bn TFL1的功能,构建了CRISPR-Cas9基因敲除载体,并获得了Bn TFL1-CRISPR转基因阳性株系。通过对Bn TFL1-CRISPR转基因株系#1和#2的T1代植株进行Hi-TOM基因编辑突变检测,发现这两个Bn TFL1-CRISPR的T1代植株中有30株植株的靶序列1的基因型为杂合子,碱基由C突变至T,但并未改变氨基酸序列。综上所述,油菜Bn TFL1为At TFL1的同源基因,该基因定位于细胞质和细胞核,过量表达Bn TFL1将会导致油菜结实率降低。本研究初步探讨了甘蓝型油菜Bn TFL1基因的生物学功能,为油菜品种的花序遗传改良奠定了理论基础。
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