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近年来,同时检出blaCTX-M和mcr-1的大肠杆菌不断被报道,但河南省鸡源大肠杆菌中有关两者的遗传背景及散播机制尚不明晰。因此,本试验以河南省同时携带blaCTX-M和mcr-1的鸡源大肠杆菌为研究对象来探究其共同传播机制,为临床防控和治疗提供理论基础。
本试验在14株鸡源大肠杆菌临床分离株中检测到12株受试菌同时携带blaCTX-M和mcr-1,其中9株受试菌筛选获得同时含有blaCTX-M和mcr-1的接合子。药敏结果显示,9株临床分离菌及接合子对头孢噻肟、黏菌素、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类及喹诺酮类等呈现不同程度的耐药。blaCTX-M分型结果可知,9株临床分离菌均携带1-2个blaCTX-M亚型,分别属于blaCTX-M-1(blaCTX-M-55亚型)和blaCTX-M-9(blaCTX-M-14和blaCTX-M-27亚型)亚群,而相应的接合子仅检测出单个的blaCTX-M亚型。受试菌及接合子均同时检出不少于两个的复制子类型(接合子LWY6J除外),其中以IncHI2和IncI1复制子为主。
通过S1-PFGE及全基因组测序,对菌株LWY24及LWY6及其质粒的基因图谱进行了分析,结果显示LWY24中存在4个质粒,包括携带blaCTX-M-55、blaTEM-1b及rmtB的IncFⅡ型质粒(pLWY24J-3)、携带mcr-1的IncI2型质粒(pLWY24J-mcr-1)和无抗性的IncI1型质粒(pLWY24J-4)等三个接合型质粒和一个携带blaCTX-M-14、fosA3、floR等15个耐药基因的IncHI2/IncHI2A非接合质粒(pLWY24)。LWY6中有两个接合型质粒,其中IncHI2质粒pLWY6J-MC同时携带mcr-1、blaCTX-M-14、fosA3和sul2等11个耐药基因,而IncFⅡ型质粒pLWY6-2未携带已知耐药基因。同时,LWY6的染色体上还携带有blaCTX-M-55。此外,上述耐药性质粒均携带了大量的插入序列和转座子,表明blaCTX-M和mcr-1水平传播以质粒接合、重排和转座为主。
通过再接合试验、生长曲线测定、质粒稳定性试验及竞争性试验评价LWY24菌中pLWY24J-3和pLWY24J-mcr-1的适应性和相互影响。结果显示在不同的筛选条件下,共获得6个携带不同质粒组合的接合子,分别为C600FⅡ(仅携带含blaCTX-M-55的IncFⅡ质粒)、C600FⅡ+I1(携带IncFⅡ质粒和无抗IncI1质粒)、C60012(仅携带含mcr-1的IncI2质粒)、C600I2+I1(携带IncI2质粒和IncI1质粒)、C600FⅡ+I2(携带IncFⅡ1质粒和IncI2质粒)和C600FⅡ+I2+I1(携带这三个质粒)。生长曲线结果显示,不同质粒的加入,对受体菌C600的生长速率无明显影响。再接合试验表明,pLWY24J-3在加入pLWY24J-mcr-1后(C600FⅡ+I2),与单一pLWY24J-3质粒(C600FⅡ)相比,接合频率显著提高(p<0.05)。同时,在pLWY24J-4存在时(C600FⅡ+I1),pLWY24J-3接合频率极显著降低(p<0.0001);但当第三个质粒pLWY24J-mcr-1共存时(C600FⅡ+I2+I1),pLWY24J-3的接合频率又极显著升高(p<0.0001)。质粒稳定性结果显示,与pLWY24J-3单独存在(C600FⅡ)相比,pLWY24J-3和pLWY24J-mcr-1共存(C600FⅡ+I2)稳定性显著提高。体外竞争试验表明,两质粒的共存较IncI2(pLWY24J-mcr-1)单质粒有明显的竞争优势。
综上所述,blaCTX-M和mcr-1共存时的水平转移方式多样化,既可以同时转移,又可以单独转移,且质粒接合、插入序列的转座和重排是导致blaCTX-M和mcr-1快速传播的主要原因。pLWY24J-mcr-1(IncI2)和pLWY24J-3(IncFⅡ)质粒的共存提高了pLWY24J-3的接合转移和稳定性。
本试验在14株鸡源大肠杆菌临床分离株中检测到12株受试菌同时携带blaCTX-M和mcr-1,其中9株受试菌筛选获得同时含有blaCTX-M和mcr-1的接合子。药敏结果显示,9株临床分离菌及接合子对头孢噻肟、黏菌素、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类及喹诺酮类等呈现不同程度的耐药。blaCTX-M分型结果可知,9株临床分离菌均携带1-2个blaCTX-M亚型,分别属于blaCTX-M-1(blaCTX-M-55亚型)和blaCTX-M-9(blaCTX-M-14和blaCTX-M-27亚型)亚群,而相应的接合子仅检测出单个的blaCTX-M亚型。受试菌及接合子均同时检出不少于两个的复制子类型(接合子LWY6J除外),其中以IncHI2和IncI1复制子为主。
通过S1-PFGE及全基因组测序,对菌株LWY24及LWY6及其质粒的基因图谱进行了分析,结果显示LWY24中存在4个质粒,包括携带blaCTX-M-55、blaTEM-1b及rmtB的IncFⅡ型质粒(pLWY24J-3)、携带mcr-1的IncI2型质粒(pLWY24J-mcr-1)和无抗性的IncI1型质粒(pLWY24J-4)等三个接合型质粒和一个携带blaCTX-M-14、fosA3、floR等15个耐药基因的IncHI2/IncHI2A非接合质粒(pLWY24)。LWY6中有两个接合型质粒,其中IncHI2质粒pLWY6J-MC同时携带mcr-1、blaCTX-M-14、fosA3和sul2等11个耐药基因,而IncFⅡ型质粒pLWY6-2未携带已知耐药基因。同时,LWY6的染色体上还携带有blaCTX-M-55。此外,上述耐药性质粒均携带了大量的插入序列和转座子,表明blaCTX-M和mcr-1水平传播以质粒接合、重排和转座为主。
通过再接合试验、生长曲线测定、质粒稳定性试验及竞争性试验评价LWY24菌中pLWY24J-3和pLWY24J-mcr-1的适应性和相互影响。结果显示在不同的筛选条件下,共获得6个携带不同质粒组合的接合子,分别为C600FⅡ(仅携带含blaCTX-M-55的IncFⅡ质粒)、C600FⅡ+I1(携带IncFⅡ质粒和无抗IncI1质粒)、C60012(仅携带含mcr-1的IncI2质粒)、C600I2+I1(携带IncI2质粒和IncI1质粒)、C600FⅡ+I2(携带IncFⅡ1质粒和IncI2质粒)和C600FⅡ+I2+I1(携带这三个质粒)。生长曲线结果显示,不同质粒的加入,对受体菌C600的生长速率无明显影响。再接合试验表明,pLWY24J-3在加入pLWY24J-mcr-1后(C600FⅡ+I2),与单一pLWY24J-3质粒(C600FⅡ)相比,接合频率显著提高(p<0.05)。同时,在pLWY24J-4存在时(C600FⅡ+I1),pLWY24J-3接合频率极显著降低(p<0.0001);但当第三个质粒pLWY24J-mcr-1共存时(C600FⅡ+I2+I1),pLWY24J-3的接合频率又极显著升高(p<0.0001)。质粒稳定性结果显示,与pLWY24J-3单独存在(C600FⅡ)相比,pLWY24J-3和pLWY24J-mcr-1共存(C600FⅡ+I2)稳定性显著提高。体外竞争试验表明,两质粒的共存较IncI2(pLWY24J-mcr-1)单质粒有明显的竞争优势。
综上所述,blaCTX-M和mcr-1共存时的水平转移方式多样化,既可以同时转移,又可以单独转移,且质粒接合、插入序列的转座和重排是导致blaCTX-M和mcr-1快速传播的主要原因。pLWY24J-mcr-1(IncI2)和pLWY24J-3(IncFⅡ)质粒的共存提高了pLWY24J-3的接合转移和稳定性。