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灯盏花素对吸烟大鼠脑血管内皮细胞ICAM-1和ICAM-1 mRNA表达影响的实验研究前言吸烟是心脑血管病发生发展的重要可干预危险因素之一。有研究表明吸烟可使细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达升高，并且升高程度与吸烟量呈正相关。ICAM-1主要由血管内皮细胞表达，在缺血性卒中时介导血管内皮细胞与中性粒细胞的黏着，中性粒细胞附壁，游出，发挥多种效应，引起缺血性损伤。核转录因子-κB(NF-κB)是能够调整免疫及炎症基因表达的一个重要细胞信号转导分子，对ICAM-1表达有调控作用。蛋白激酶C(PKC)是NF-κB的一种上游激酶，广泛参与细胞信号转导、细胞分化、基因激活等。PKC通过参与κB抑制蛋白(IκB)的磷酸化，使IκB与NF-κB解离而使其激活。PKC抑制剂则可阻断该途径。本实验用灯盏花注射液做为PKC抑制剂。通过探讨PKC抑制剂对吸烟因素引起的细胞间黏附分子-1表达的影响，研究PKC抑制剂对吸烟条件下脑梗死的干预作用及最佳治疗时间窗。材料与方法一、实验材料1、实验动物：8周龄健康雄性Wistar大鼠66只，体重280～320g。(中国医科大学实验动物中心提供)2、主要试剂：ICAM-1(CD54)免疫组化试剂盒及原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司；灯盏花注射液购自云南制药公司；核甘酸酶抑制剂(DEPC)购于Sigma公司。3、主要仪器：光学显微镜、石蜡切片机、图像采集及分析系统。二、实验方法1、实验动物分组：66只大鼠随机分为未梗死组18只和梗死组48只。未梗死组不给予线栓法大脑中动脉梗死，再随机分为不吸烟对照组6只、吸烟PKC抑制剂组6只和吸烟未给药组6只，给PKC抑制剂4小时后取脑。梗死组给予线栓法大脑中动脉梗死，再随机分为给PKC抑制剂组24只，未给药组24只。2、制作吸烟大鼠模型：参照Chow等吸烟灌注模型自制熏烟笼，使用市售某品牌香烟，大鼠日被动吸烟5支×4次，共12周。3、制作大脑中动脉梗死模型：采用Longa线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉闭塞，模型成功标志：动物苏醒后提尾时右侧前肢内收屈曲，同侧Homer征，爬行时向右侧划圈，站立时向右侧倾倒，取脑时未见蛛网膜下腔出血。4、免疫组化法检测ICAM-1及原位杂交法检测ICAM-1 mRNA：灌流，取脑，石蜡包埋，切片厚5μm。免疫组化法检测ICAM-1和原位杂交法检测ICAM-1mRNA。对切片进行图像采集并进行胞浆灰度分析。胞浆灰度值小表明ICAM-1蛋白和ICAM-1 mRNA表达强，反之则弱。阳性染色主要见于小动脉内皮细胞，可见各组大鼠脑血管内皮细胞均表达ICAM-1和ICAM-1 mRNA。不吸烟大鼠则未见明显表达。5、统计学处理：每例动物检测2张切片，每张切片选取5个不重叠视野观察皮质内血管内皮细胞，测其胞浆染色平均灰度值，计算每例动物脑皮质内血管内皮细胞胞浆染色平均灰度值，采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析及t检验。脑梗死组各组数据行单因素方差分析ANOVA，组间变量行两两比较的SNK法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。结果不吸烟对照组脑皮质血管内皮细胞胞浆极少量ICAM-1和ICAM-1mRNA染色；吸烟鼠脑皮质内血管内皮细胞胞浆染色最深，胞浆灰度值最小，ICAM-1和ICAM-1mRNA表达最多；PKC抑制剂组吸烟鼠脑皮质内血管内皮细胞胞浆染色较浅，胞浆灰度值较小，ICAM-1和ICAM-1mRNA表达较少。对梗死组不同时间点胞浆灰度值行重复测量的方差分析显示给与PKC抑制剂越早越能阻断ICAM-1和ICAM-1mRNA表达增加的趋势。结论PKC抑制剂可减少吸烟大鼠脑皮质血管内皮细胞ICAM-1和ICAM-1 mRNA的表达。对未发生脑梗死吸烟大鼠可预防脑梗死发生；对已发生脑梗死吸烟大鼠可通过阻断ICAM-1和ICAM-1 mRNA的表达，起到脑保护作用，并且早期用药效果更好。