论文部分内容阅读
目的:弓形虫是一种专性的细胞内寄生原虫,孕期弓形虫感染可导致流产、死胎等不良妊娠结局,严重影响人类的优生优育。以往的研究主要集中在孕妇弓形虫感染对胎儿毒性作用的临床表现和流行病学调查方面,而其致不良妊娠机制方面的研究,国内外尚未见系统报道。本实验建立孕中期弓形虫感染的孕鼠模型,研究(1)弓形虫感染对胎鼠的生长发育及体内微量元素的影响;(2)弓形虫感染对胎盘组织细胞凋亡及凋亡调控基因bax、bcl-2表达的影响;(3)弓形虫感染对孕鼠血清中孕酮、雌三醇含量的影响;(4)弓形虫感染对孕鼠血红系列及血清铁蛋白含量的影响;初步探讨孕中期弓形虫感染对孕鼠及胎鼠的毒性作用。方法:取9~10周龄的BALB/c处女鼠,体重22±1g,与雄鼠合笼。在孕8天,检出孕鼠160只,随机分为染虫组(100只)和正常对照组(60只)。染虫组经腹腔接种纯化的RH株弓形虫速殖子(100个/0.2ml/只);正常对照组注射等量0.01MPBS(pH7.3)。于孕10、12、14、16、18天分别处死染虫组孕鼠20只,正常对照组12只。(1)每组1/2的孕鼠经摘眼球取血,分离血清,采用放射免疫法检测孕鼠血清中孕酮(P)、雌三醇(E3)、铁蛋白(Ferr)含量;(2)其余1/2的孕鼠取全血,抗凝处理,进行血红系列分析;(3)全部孕鼠剖腹,剥离胎鼠,记录胚胎总数、死胎数、活胎数;测量胎鼠的身长、尾长;采用原子吸收分光光度法检测胎鼠体内微量元素Zn、Cu、Fe的含量;采用比色法测定胎鼠体内总蛋白含量;胎鼠经Bouin’s液固定,切片,作3,3’-二氨基联苯胺(DAB)增强的Perl’s铁染色,观察胎鼠整体切片、胎肝、胎脑组织中铁的分布;(4)剥离孕鼠胎盘,一部分胎盘作组织压片,姬瑞氏染色,观察胎盘中虫体的感染情况;其余胎盘经Bouin’s液固定、切片,一部分切片经HE染色,观察其病理变化;一部分切片经DNA缺口末端标记技术(TUNEL)检测胎盘组织细胞凋亡情况,并计算凋亡指数(AI);其余切片采用免疫组织化学染色法检测胎盘组织弓形虫抗原、细胞凋亡调控基因bax和bcl-2的表达情况。结果:(1)观察胎鼠一般状况,发现在孕14、16、18天,染虫组的胚胎总数、活胎数、胎鼠的平均体重与正常对照组相比均明显减少(P<0.05)。染虫组胎鼠平均身长、尾长在孕14天时虽有下降,但无统计学意义(P>0.05);而孕16、18天时均明显下降(P<0.05)。(2)胎鼠体内微量元素Zn、Cu、Fe的含量测定显示,染虫组胎鼠Zn含量在孕12~18天均低于正常组(P<0.05);Cu含量在孕10、12、14天均与正常组无差异,而在孕16、18天均低于对照组(P<0.05);Fe含量在孕12~18天均低于正常组(P<0.05),其中孕12、14天时下降的最显著(P<0.01)。(3)胎鼠组织切片铁染色呈棕黄色颗粒,染虫组胎鼠整体切片、胎肝及胎脑铁染色强度与正常组相比均明显减弱。(4)胎鼠体内总蛋白含量测定显示,染虫组孕14天胎鼠总蛋白含量与对照组无差别(P>0.05),而孕16、18天均明显减少(P<0.01)。(5)随着感染时间的延长,染虫组胎盘组织中的虫体逐渐增多,切片HE染色可见绒毛有炎性病变;有的细胞缩小、胞浆浓缩,可见凋亡小体形成。(6)经TUNEL证实,染虫组和对照组孕鼠胎盘组织中均可见凋亡细胞存在,且随着妊娠期的延长而增加。在孕14、16、18天,染虫组的细胞凋亡指数(AI)显著高于对照组(P<0.01)。(7)免疫组化显示,染虫组孕鼠胎盘组织的合体滋养层细胞中可见弓形虫抗原的表达;Bax随妊娠天数的增加在胎盘绒毛和蜕膜组织中表达增强;而Bcl-2主要表达于合体滋养层,表达量随着妊娠期逐渐减弱。在孕晚期,染虫组Bax表达显著高于对照组(P<0.05),而Bcl-2表达显著低于对照组(P<0.05),Bax/Bcl-2比值显著高于对照组(P<0.05)。(8)放射免疫测定显示,在孕10、12、14天,染虫组孕鼠血清中P、E3含量与对照组无差别(P>0.05);而在孕16、18天时显著低于对照组(P<0.01)。(9)孕鼠血红系列分析显示:①染虫组与对照组孕鼠的全血红细胞(RBC)计数、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)均无差别(P>0.05)。②染虫组孕鼠的红细胞体积分布宽度(RDW)与对照组相比有轻微增加,但无统计学意义(P>0.05)。③染虫组孕鼠红细胞平均体积(MCV)在孕10、14天与对照组比较无差别(P>0.05),在孕12天减小(P<0.05),在孕16、18天显著减小(P<0.01)。④染虫组孕鼠红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)在孕10、12天与对照组比较无差别(P>0.05),而在孕14、16、18天明显降低(P<0.01)。(10)放射免疫测定显示,染虫组孕鼠血清铁蛋白含量在孕10、12、14天轻微降低,但无统计学意义(P>0.05);而在孕16、18天显著低于对照组(P<0.01)。结论:(1)孕中期弓形虫感染不仅可引起胚胎总数和活胎数减少、胎鼠平均体重减轻、身长及尾长缩短,而且可引起胎鼠总蛋白及微量元素Zn、Cu、Fe含量下降,表明孕中期弓形虫感染可引起胚胎营养不良和发育障碍。(2)孕中期弓形虫感染可引起胎盘组织炎性病变;可引起绒毛组织中bax过度表达,bcl-2表达减少,二者比例失衡可诱导滋养层细胞凋亡增加。炎性病变及凋亡的增加可降低胎盘的物质转运及内分泌的功能,影响胚胎生长发育,是弓形虫感染致孕鼠生殖毒性和胚胎发育毒性的病理基础。(3)孕中期弓形虫感染可引起孕鼠血清中P、E3含量下降,既可能是弓形虫感染致胚胎发育迟缓、胎盘组织炎性病变及滋养层细胞凋亡增加的结果,也可能是胚胎发育迟缓、滋养层细胞凋亡增加的原因。(4)孕中期弓形虫感染可引起孕鼠红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)及血清铁蛋白含量下降,表明孕鼠有轻度低铁血症。这可能是弓形虫感染孕鼠,引起胎鼠体内Fe含量下降及胎鼠各器官的发育迟缓的原因之一。