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近几年来恶性肿瘤的发病死亡率均呈持续上升态势,并且表现出年轻化趋势,是威胁中国人群健康的主要疾病之一。2020年乳腺癌（breast cancer,BC）新发病例第一,成为世界第一大癌症。肿瘤免疫治疗是近年来癌症治疗领域的研究热点,免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）现已进入临床试验,并已成为最重要的免疫疗法之一,与传统癌症治疗相比副作用小,针对性更强。考虑到肿瘤免疫过程复杂,会涉及多个免疫检查点分子的异常表达,因而出现肿瘤免疫联合治疗。程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death 1,PD-1）是一种免疫检查点抑制性受体,程序性细胞死亡蛋白1配体（programmed cell death-ligand,PD-L1）是主要在肿瘤细胞上表达的负调控分子,促进免疫逃逸。PD-1/PD-L1信号通路通过抑制T细胞功能来抑制抗肿瘤免疫。抗PD-1/PD-L1抗体可以恢复部分T细胞的免疫效应功能,达到抗肿瘤的目的。目前,美国食品药品监督管理局（Foodand Drug Administration,FDA）批准的 PD-1 抗体药物主要包括 Nivolumab、Pembrolizumab和 Cemiplimab 以及抗 PD-L1 抗体 Avelumab,Atezolizumab 和 Durvalumab。4-1BB（CD137/TNFRSF9）主要是在活化的自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）,自然杀伤 T 细胞（natural killer T cell,NKT）,树突状细胞（dendritic cells,DCs）和T细胞等免疫细胞上广泛表达的诱导型共刺激受体。4-1BB与其配体4-1BBL结合能够诱导T细胞增殖和细胞因子分泌。抗4-1BB激动剂单抗在几种动物肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤能力,目前,两种抗4-1BB单克隆抗体Urelumab和Utomilumab正在临床试验中。研究目的:研究4-1BB激活与PD-L1阻断治疗对BC小鼠肿瘤生长,生存期的影响以及对肿瘤引起的脏器损伤调节作用。研究方法:1.在6-8周龄雌性BALB/C小鼠乳腺脂肪垫的位置皮下接种4T1.2肿瘤细胞（1×105/mouse）,构建BC荷瘤小鼠模型。待第5天肿瘤长出后,随机分为4组进行腹腔注射,注射试剂或抗体药物为:1)PBS;2)anti-PD-L1mAb;3)anti-4-1BB mAb;4)anti-PD-L1 mAb 和 anti-4-1BB mAb,抗体注射浓度为150μg/100ul/mouse,每隔三天治疗一次,共治疗四次。记录小鼠肿瘤生长和生存情况;2.另外构建4T1.2小鼠模型,治疗方法同上。当小鼠中最大肿瘤长径达到15mm,所有小鼠安乐死,取心、肝、脾、肺、肾和肠拍照后放入4%甲醛固定,经脱水包埋和4μm连续性切片后,进行HE染色和免疫组织化学染色,观察脏器损伤及免疫治疗后的改善情况,对各脏器损伤程度和T淋巴细胞浸润程度进行评分。3.再次构建同种模型,第二次治疗48h后,采用流式细胞术观察肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞的浸润。研究结果:1.anti-PD-L1 mAb和anti-4-1BB mAB治疗后小鼠肿瘤生长缓慢,联合治疗显著抑制肿瘤生长,与anti-PD-L1组差异显著（P＜0.01）,部分小鼠肿瘤消退,并且显著延长小鼠生存期（P＜0.01）,但与anti-4-1BB组差别不显著。Anti-4-1BB组和联合治疗组肿瘤微环境中CD8+T淋巴细胞浸润较明显。2.正常组脾脏体积明显小于PBS组、anti-PD-L1组、anti-4-1BB组以及联合治疗组（P＜0.05）,联合治疗组脾脏大小最接近正常组但仍没有恢复到脾脏正常大小;PBS组小鼠脾脏白髓萎缩甚至消失,红髓扩张,充血严重,有大量炎症细胞浸润,抗PD-L1 mAb和抗4-1BB mAb治疗后上述症状改善,联合治疗后改善明显,病理损伤评分联合治疗组明显低于PBS组和抗PD-L1组（P＜0.0001;P＜0.01）,与抗4-1BB组差异不显著,但仍明显高于正常组（P＜0.0001）。3.PBS组肠与正常组相比明显缩短（P＜0.05）,各治疗组之间长度差异不显著;PBS组小鼠肠有大量炎症细胞浸润,部分肠腺形态不完整,绒毛基本完整,抗PD-L1 mAb治疗后改善不明显,抗4-1BB mAb和联合治疗后改善明显,与PBS组和抗PD-L1组相比,联合治疗组病理损伤评分明显降低（P＜0.01;P＜0.05）,与抗4-1BB组差异不显著,但仍明显高于正常组（P＜0.01）。4.PBS组小鼠肝脏表观变化不明显;PBS组小鼠肝脏结构不清晰,中央静脉、汇管区有大量炎症细胞浸润,肝小叶间炎症细胞浸润并发生灶状坏死,抗PD-L1 mAb和抗4-1BB mAb治疗可以改善炎症浸润程度,联合治疗后改善明显,病理损伤评分联合治疗组明显低于PBS组和抗PD-L1组（P＜0.01;P＜0.05）,与抗4-1BB组差异不显著,但仍明显高于正常组（P＜0.0001）。5.PBS组小鼠肺体积增大;PBS组小鼠肺间隔增宽,间质充血,有大量炎症细胞浸润,抗PD-L1 mAb治疗后改善不明显,抗4-1BB mAb和联合治疗后上述症状改善,但仍有少量炎症细胞浸润,病理评分统计联合治疗组病理损伤评分明显低于PBS组和抗PD-L1组（P＜0.001;P＜0.01）,与抗4-1BB组差异不显著,但仍明显高于正常组（P＜0.01）。6.PBS组小鼠肾表观变化不明显;PBS组小鼠肾小球增大,肾小球内细胞增多,抗PD-L1 mAb治疗后改善不明显,抗4-1BB mAb和联合治疗后改善明显,接近正常,病理损伤评分联合治疗组明显低于PBS组和抗PD-L1组（P＜0.01;P＜0.05）,与正常组差异不显著。7.PBS组小鼠心脏未见明显损伤变化,各治疗组之间差别不明显。8.PBS组小鼠的肺、肝和肠有较多T细胞浸润,免疫治疗后细胞浸润数量减少,4-1BB抗体和联合治疗效果较明显,心和肾各组间无统计学意义。研究结论:抗PD-L1 mAb联合抗4-1BB mAb治疗比单药治疗具有更好的抗肿瘤效果,同时能够显著延长小鼠生存期,引起小鼠肿瘤消退。荷瘤小鼠中可见脾肿大、肠萎缩和肺增大现象,肿瘤可以引起肝、脾、肺、肾、肠不同程度的损伤,促进炎症,PD-L1单抗治疗有一定的改善作用,4-1BB单抗和联合治疗效果较明显。