磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一。土壤中大部分磷是以有机磷或固定态无机磷形式存在,而植物能直接吸收利用的水溶性无机磷含量远远不能满足植物正常生长发育的需要,因此植物进化了多种生理及生化机制适应缺磷环境。缺磷会诱导植物合成酸性磷酸酶并分泌到环境或细胞壁中,降解有机磷释放出无机磷供植物吸收利用。本研究首先利用蛋白组分析,从水稻悬浮细胞中筛选缺磷诱导的分泌型紫色酸性磷酸酶,发现OsPAP10a和OsPAP10c是水稻中两个缺磷诱导的分泌型酸性磷酸酶。已有研究报道超表达水稻紫色酸性磷酸酶OsPAP10a和OsPAP10c可以提高水稻有机磷的利用率,但是这两个同源基因是否存在功能冗余及如何参与缺磷胁迫的分子机制尚不清楚。为了阐明OsPAP10a和OsPAP10c参与缺磷胁迫的分子机制,本研究针对这两个基因开展了详细的生理、生化和分子生物学研究,获得的主要结论如下:1.缺磷诱导分泌的酸性磷酸酶主要受Os PHR2介导的磷信号网络调控为了鉴定水稻中缺磷诱导的分泌型酸性磷酸酶,本研究利用正常和缺磷培养的水稻野生型和Os PHR2超表达材料的悬浮细胞培养液共鉴定到652个分泌蛋白,其中17个酸性磷酸酶受到缺磷显著诱导表达。在这些受缺磷诱导的酸性磷酸酶中,有8个紫色酸性磷酸酶受到Os PHR2的显著诱导。与此一致,生理实验证明Os PHR2超表达可以提高根系表面以及细胞壁中的酸性磷酸酶活性,进而促进环境中有机磷的利用,说明缺磷诱导的分泌型酸性磷酸酶活性提高主要受到磷信号核心转录因子Os PHR2的调控。2.细胞壁定位的OsPAP10a调控植株体内无机磷平衡OsPAP10a作为一个受缺磷诱导的分泌型酸性磷酸酶,定量PCR证明OsPAP10a在根部和叶片中均受缺磷诱导表达。GUS组织染色显示在根部组织中,OsPAP10a主要在皮层和维管组织表达,在叶片组织中,OsPAP10a在表皮细胞、叶肉细胞和维管组织均有表达。将OsPAP10a-GFP融合蛋白在烟草中表达显示,OsPAP10a主要分泌至质外体中。以此对应,与野生型相比,pap10a突变体的根表和细胞内酸性磷酸酶活性差异不大,但是缺磷条件下,突变体叶片和根系细胞壁中的酸性磷酸酶活性显著下降,证明OsPAP10a是一个分泌至细胞壁中的酸性磷酸酶。与野生型相比,pap10a突变体叶片的总磷含量没有变化,但是老叶中的无机磷含量降低。相反,OsPAP10a超表达材料老叶的无机磷含量升高。表达纯化的OsPAP10a蛋白可以高效降解多种含磷有机物,其中对磷酸烯醇式丙酮酸和焦磷酸的活性最高。转录组结果发现,与野生型相比,pap10a突变抑制表达的基因中,叶片和根系中分别有46%和82%受缺磷诱导表达。KEGG富集分析发现根系中参与缺磷诱导的糖代谢支路被显著抑制。以上结果说明,OsPAP10a可能参与调控细胞内糖代谢途径过程,进而影响植株无机磷平衡。3.OsPAP10c是水稻根系分泌的最主要的酸性磷酸酶OsPAP10c是Os PHR2诱导最显著的分泌型酸性磷酸酶,本研究中创制了该基因的两个独立突变体pap10c-1和pap10c-2。与野生型相比,BCIP染色显示pap10c突变体在正常和缺磷条件下根表酸性磷酸酶活性显著下降。同时,该突变体在正常和缺磷条件下分泌的酸性磷酸酶活性也降低了50%以上,且活性胶染色显示突变体比野生型缺少一条受缺磷诱导的同工酶谱带,以上结果表明OsPAP10c是水稻缺磷诱导的最主要的分泌型酸性磷酸酶。通过q RT-PCR和POsPAP10c::GUS组织染色,表明OsPAP10c在水稻根系表皮细胞中受缺磷特异诱导表达,与其分泌功能一致。4.增加OsPAP10c拷贝数可以促进水稻生长和提高产量前期研究发现,虽然组成型超表达OsPAP10c可以显著提高组织和分泌性酸性磷酸酶活性,但是转基因材料在正常供磷条件下生长受到抑制,推测可能是组成型启动子造成该基因在所有组织中均过量表达,从而造成的生长负担。为了避免这种情况,本研究中用OsPAP10c自身启动子驱动OsPAP10c(PPAP10c::OsPAP10c)表达,结果发现PPAP10c::OsPAP10c转基因材料也能显著提高分泌型酸性磷酸酶活性和有机磷利用能力。同时,由于PPAP10c::OsPAP10c转基因水稻避免了在其它组织中表达较高活性的酸性磷酸酶,其植株生长显著优于野生型和组成型启动子超表达材料。在大田施用不同水平磷肥条件下,PPAP10c::OsPAP10c转基因材料不仅长势优于野生型,而且结实率、穗粒数和单株产量均显著高于野生型。综上所述,本研究主要解析了水稻中2个主要的参与缺磷适应性的分泌型酸性磷酸酶功能。其中OsPAP10a是一个细胞壁定位的酸性磷酸酶,可能通过降解细胞壁中多种有机磷物质含量,影响缺磷诱导的糖代谢支路和无机磷的平衡。而OsPAP10c是水稻根系向环境中分泌的最主要酸性磷酸酶,PPAP10c::OsPAP10c转基因材料可以促进水稻的生长和提高单株产量。