论文部分内容阅读
宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，发病率高，死亡率高，发病年龄年轻化趋势明显，且其治疗手段的可供选择不多，对其发生发展的分子生物学机制和预防治疗手段的探讨具有极其重要的意义。现有研究表明，p16（cyclin-dependent kinase inhibitor2A，CDKN2A）和O-6-甲基乌嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)均是机体重要的抑癌基因，并且它们均在宫颈癌中存在基因启动子甲基化，但研究同时发现其在宫颈癌中呈现高表达。因此，p16和MGMT在宫颈癌中的作用尚需进一步研究。5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5-Aza-dC)是一种DNA甲基化转移酶抑制剂，可使一些在肿瘤中高甲基化的肿瘤抑制基因重新表达而发挥抗肿瘤的效应。虽临床上已用于白血病的治疗，但对其在其他肿瘤的治疗作用以及具体机制仍不十分清楚。因此，本研究针对肿瘤抑制基因p16、MGMT，5-Aza-dC和放疗间的关系进行研究探讨，为宫颈癌的治疗寻求新的靶点，探索新的思路。 目的： 探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)和放疗对宫颈癌细胞系的增殖抑制作用与p16和MGMT基因表达的关系。 方法： 用5-Aza-dC处理4种宫颈癌细胞系（HeLa、SiHa、C33A和CaSki）后，甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)检测p16和MGMT的甲基化变化。宫颈癌细胞系分别或共转染p16和MGMT siRNAs、p16和MGMT过表达载体、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)E6和E7基因的过表达载体，然后进行5-Aza-dC或放疗处理，荧光定量PCR和Western blot检测p16和MGMT的表达情况，MTT检测细胞增殖，用AnnexinⅤ-FITC/PI双染或PI检测细胞凋亡和周期。进一步用荧光定量PCR检测E6、E7、p53、p21和Rb的表达。 结果： 5-Aza-dC处理宫颈癌细胞系后，可以抑制细胞的增殖并促进其凋亡，能逆转p16和MGMT的甲基化程度，但却抑制它们的表达。p16和MGMTsiRNA转染或单独5-Aza-dC处理细胞时均能引起S期阻滞;p16和MGMT siRNA转染后再进行5-Aza-dC处理时，细胞增殖率明显下降，且Sub-G1峰和S期细胞比例显著增加，表明凋亡率明显上升。放疗能引起细胞G2/M期阻滞，而p16和MGMTsiRNA转染后再进行放疗时，细胞增殖率也明显下降，且Sub-G1峰比例显著增加，凋亡增强。而且MGMT下调时对5-Aza-dC和放疗的效果最为明显。5-Aza-dC处理抑制HPV E6和E7基因表达的下调，同时促进p53、p21和Rb的表达，且p16和MGMTsiRNA促进上述作用。 结论： 1.5-Aza-dC降低宫颈癌细胞系p16和MGMT基因启动子甲基化程度的同时却抑制它们的表达; 2.5-Aza-dC抑制宫颈癌细胞系的增殖并促进其凋亡，引起S期阻滞。下调p16或MGMT，均能增敏5-Aza-dC的抗肿瘤效应; 3.放疗能引起宫颈癌细胞系G2/M期阻滞。下调p16或MGMT，均能增加细胞对放疗的敏感性; 4.5-Aza-dC可能是通过抑制HPV E6和E7基因的表达，从而促进p53、p21和Rb的表达。p16和MGMT可能参与了其中的基因表达调控过程，具体机制有待进一步探讨。 创新之处： (1)具体探讨p16和MGMT表达下调与5-Aza-dC、放疗的相互影响作用; (2)深入研究p16、MGMT和5-Aza-dC对宫颈癌细胞生长的调控机制，可为宫颈癌的治疗提供新的靶点和新的思路。