利用放射线诱导治疗基因表达是近年来提出的一种肿瘤治疗新策略，即放射-基因治疗（Radio-genetic therapy），将辐射敏感性调控序列与对肿瘤具有治疗作用的基因相耦联，赋予其放射诱导特性，转入肿瘤细胞，在对肿瘤局部实施放疗时诱导肿瘤治疗基因表达，通过射线和基因双重作用杀伤肿瘤。这一疗法在已有的研究中显示出良好的应用前景。但仍存在明显的不足，辐射诱导的治疗基因表达水平低且持续短暂，尤其在临床常规放疗剂量下，不能满足治疗需要；在活体内，辐射敏感性调控序列的放射诱导活性往往低于体外培养细胞，可能与实体肿瘤细胞缺氧有关。对这些问题目前尚缺乏有效的解决办法，影响了肿瘤放射-基因治疗的疗效和应用。缺氧引起细胞发生一系列分子改变，缺氧反应元件（Hypoxia response elements，HREs）是介导细胞缺氧反应的重要调控序列，是一缺氧敏感性增强子，通过与缺氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）特异性结合诱导下游基因表达。实体瘤是一缺氧微环境，HIF-1α在肿瘤组织高表达，因此，实体瘤具有激活HRE所需的条件。为此，本研究设想用HRE反应元件增强辐射敏感性调控序列在缺氧条件下的转录活性，尤其是增强在实体瘤内的辐射敏感性，以克服上述放射-基因治疗存在的不足。早期生长反应基因-1（Early growth response gene-1，Egr-1）启动子是一种辐射敏感性调控序列，广泛用于放射-基因治疗。为探讨以上思路的可行性，本研究进行了以下实验：①构建Egr-1启动子调控的荧光素酶（Luc）报告基因载体，转染肺癌A549细胞，给以2、4、6、8、10Gy γ-线照射，观察照射后0、3、8、12、24、36h各时相点Luc表达水平，鉴定Egr-1启动子的放射诱导活性；检测以上剂量组在0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、10%等氧浓度下照射后8h的Luc表达水平，观察缺氧对Egr-1启动子辐射诱导活性的影响。进一步检测不同氧浓度下照射后过氧化氢（H2O2）产量的变化，观察缺氧对照射后氧自由基产量的影响，探讨缺氧对Egr-1启动子辐射诱导活性的作用机理。②利用基因重组技术将HRE序列与Egr-1启动子相串联，构建HRE-Egr启动子及其调控的Luc报告基因载体。转染A549细胞，给以与上相同剂量的γ-线照射，并检测照射后与上相同时相点Luc表达水平，观察HRE-Egr启动子的放射敏感性；检测以上剂量组在与上相同氧浓度下照射后8h的Luc表达水平，观察HRE-Egr启动子的缺氧敏感性，以及缺氧对其辐射诱导活性的影响。进一步检测在1%氧浓度下各<WP=12>剂量组照射后报告基因Luc表达的动态变化，观察缺氧对HRE-Egr启动子转录活性持续时间的影响。③构建分别由Egr-1和HRE-Egr启动子调控的抑瘤素M(OSM)（一种可抑制肺癌生长的细胞因子）表达载体，通过脂质体介导转染，G418加压筛选，获得阳性克隆。分为对照组、照射组（6 Gy）、缺氧组（1% O2）、照射+缺氧组（6 Gy + 1% O2）。分别用ELISA法和免疫荧光法检测OSM表达情况；流式细胞仪分析细胞周期改变；通过细胞辐射剂量-存活曲线分析D0值、氧增比（OER）、增敏比（SER）；利用TUNEL法和透射电镜观察细胞凋亡情况。④利用BALB/C裸小鼠建立移植瘤模型，根据接种细胞分为A549细胞组（n=5）、A549/pEO组(含Egr-1启动子) （n=5）、A549/pHEO组（含HRE-Egr启动子）（n=5）。待肿瘤长至一定体积，分别给以总量6 Gy（2 Gy/次，隔日一次）局部照射，其中A549细胞组设一组未经照射作为对照。观察指标包括肿瘤生长曲线、组织学改变、OSM表达水平、TCD50(50%肿瘤控制所需剂量)等。主要结果和结论如下：1．将Egr-1启动子置于Luc基因上游，构建了Egr-1启动子报告载体，转染A549细胞。结果表明，在γ-线照射下，Luc表达活性迅速显著增强，并呈现明显的照射剂量依赖性，证明本实验中Egr-1启动子具有辐射诱导活性；进一步在不同氧浓度下实施照射，结果发现，当氧浓度<2.5%时，Egr-1启动子的辐射诱导活性随氧浓度的降低而减弱；并且照射后的H2O2产量也呈现类似的变化特征。这一结果表明了缺氧可导致Egr-1启动子辐射诱导活性下降，并提示可能与H2O2等活性氧的产量减少有关。2．成功构建了HRE-Egr启动子及其调控的Luc报告基因载体pHEL。转染A549细胞，结果发现，在常氧下，HRE-Egr启动子在照射后的表达特征与Egr-1启动子相似；在氧浓度≤2.5%时，HRE-Egr启动子的表达活性明显升高，并于1%氧浓度时达最高值，在2 Gy照射时A549/pHEL细胞Luc表达量为2282±89 ng/L， 是同样条件下Egr-1启动子活性（172±20 ng/L）的13倍多。以上结果说明，嵌合型HRE-Egr启动子具有辐射和缺氧双重敏感性，并且缺氧对辐射诱导活性具有明显的增强作用。结果还发现，在缺氧条件下，HRE-Egr启动子调控的报告基因Luc表达活性持续时间明显延长，在2 Gy照射后，Lu表达活性维持36h，明显长于常氧下的12h。3．分别用Egr-1和HRE-Egr调控OSM表达，成功构建了辐射敏感性OSM表达载体pEO和缺氧/辐射双敏感性表达载体pHEO。经DOTAP脂质体介导，G418筛选，获得阳性克隆A549/pEO、A549/pHEO。结果发现，在照射合并缺氧时，A549/pHEO细胞OSM表达水平（694.97±73.72 pg/ml）明显高于A549/pEO细胞（98.97±7.95 pg/ml）?