肿瘤恶病质（Cancer cachexia,CC）是一种代谢性多因素不可逆综合征。其主要特征是体重损失,特别是骨骼肌和脂肪的消耗。骨骼肌损失导致肿瘤恶病质患者行动障碍、对癌症治疗的耐受性降低,同时也增加了并发症和死亡率。相反,研究报道通过保存骨骼肌质量可延长肿瘤恶病质患者的生存期。此外,2011年多国专家在形成《肿瘤恶病质的定义与分类—国际共识》,对肿瘤恶病质进行重新定义,也强调骨骼肌萎缩对肿瘤恶病质发病的重要性。然而,迄今为止还没有有效药物用于临床治疗肿瘤恶病质所致的骨骼肌萎缩。课题组前期进行了肿瘤恶病质生物标志物的临床研究,发现代谢改变不仅是肿瘤恶病质的重要特征,也提示代谢性生物标志物的关键限制性代谢酶表达/活性异常是肿瘤恶病质重要特征,可作为肿瘤恶病质的药物干预靶点。进一步研究表明肿瘤恶病质骨骼肌萎缩与支链氨基酸（Branched chain amino acid,BCAA）代谢过程密切相关。BCAA的限制性不可逆代谢酶是支链α-酮酸脱氢酶复合物（Branched-Chain alpha-keto acid dehydrogenase complex,BCKDC）。预实验研究发现肿瘤恶病质小鼠腓肠肌和地塞米松处理的C2C12肌小管中,BCKDC蛋白活性明显上升。而BCKDC可被BDKDC激酶（BCKD kinase,BDK）磷酸化失活,被BCKDC磷酸酶（BCKD phosphatase,BDP）去磷酸化活化。前期研究发现干扰BDK表达或特异性抑制BDK活性可引起BCKDC活性升高,并伴随肌生成蛋白表达减少。为此,本课题研究认为BDK抑制是肿瘤恶病质骨骼肌萎缩的新机制。苦参碱是苦参的主要成分之一。据研究证实,苦参碱在抗肝炎、心肌损伤、纤维化疾病及肿瘤方面有着广泛疗效。近年来,有研究表明苦参碱在抗肿瘤恶病质方面有一定疗效,并且目前国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration,CFDA）已经批准苦参碱注射液应用于临床预防和治疗肿瘤恶病质。但是苦参碱对肿瘤恶病质作用机制目前仍不明确,特别是对骨骼肌的作用仍有待深入研究。预实验研究表明,苦参碱在改善地塞米松诱导的C2C12肌小管萎缩、增加肌生成蛋白MyoD表达同时,还可上调BDK表达。并且,敲减C2C12肌小管中的BDK基因后,苦参碱对地塞米松诱导的肌生成蛋白表达下调逆转作用减弱。综上所述,我们提出假说:苦参碱通过BDK调控肌蛋白合成与降解,从而改善肿瘤恶病质骨骼肌萎缩。目的:1.明确苦参碱改善肿瘤恶病质骨骼肌萎缩的作用特征。2.阐明BDK对骨骼肌萎缩的调控及对肌蛋白合成和降解的影响。3.探讨苦参碱改善恶病质骨骼肌萎缩作用与BDK调控的关系。方法:1.使用CT26小鼠结肠癌细胞建立肿瘤恶病质骨骼肌萎缩模型,检测苦参碱对CT26肿瘤生长、小鼠体重、脏器组织质量、摄食及血清炎症因子水平的影响,同时采用HE染色、qPCR、Western blot及免疫组织荧光检测苦参碱对小鼠骨骼肌肌纤维的作用及对E3泛素连接酶、肌蛋白表达的调控。2.体外实验分别以地塞米松（Dexamethasone,Dex）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNFα）、CT26细胞培养基上清建立C2C12细胞萎缩模型,以苦参碱进行干预治疗。采用免疫荧光染色观察苦参碱对C2C12成肌细胞的分化、C2C12肌小管的萎缩的影响。采用Western blot、qPCR及免疫荧光染色等分析苦参碱对肌蛋白合成及降解相关蛋白的作用。最后,采用Western blot分析苦参碱对肌蛋白合成和降解相关信号通路作用。3.构建BDK敲减和过表达腺病毒,分别感染C2C12成肌细胞和肌小管。MTT检测BDK敲减对肌小管活力的影响。免疫荧光染色检测BDK敲减/过表达对成肌细胞分化和肌小管尺寸的影响。qPCR和Western blot检测BDK对肌蛋白合成和降解的影响。其次,通过免疫荧光染色、qPCR及Western blot检测BDK特异性活性抑制剂BT2的对C2C12肌小管萎缩和肌蛋白合成及降解的作用。采用免疫荧光和Western blot检测BDK过表达对Dex诱导的肌小管萎缩的保护作用。最后采用Western blot检测BDK对肌蛋白合成和降解相关信号通路的影响。4.采用BDK敲减/过表达腺病毒分别感染小鼠腓肠肌,研究BDK敲减/过表达对正常小鼠骨骼肌质量、肌纤维尺寸及肌蛋白合成和降解的作用。同时,考察BDK过表达对CT26肿瘤恶病质诱导的小鼠骨骼肌萎缩的保护作用。最后,采用Western blot检测BDK敲减/过表达对腓肠肌中肌蛋白合成和降解相关信号通路的影响。5.同前构建CT26小鼠肿瘤恶病质模型及Dex诱导的C2C12肌小管萎缩模型。敲减BDK表达后,HE染色、Western blot检测苦参碱对肌纤维尺寸、肌蛋白及肌蛋白合成降解相关通路的作用。结果:1.苦参碱腹腔注射治疗对CT26肿瘤的生长无显著抑制作用,但可缓解小鼠体重减轻,改善脏器表现以及降低血清炎症因子TNFα、IL-6及IL-1β水平。同时,苦参碱改善肿瘤恶病质小鼠骨骼肌质量。机制研究表明,苦参碱降低了恶病质小鼠骨骼肌中E3泛素连接酶的表达,对肌蛋白有保存作用。2.体外研究表明,苦参碱可促进C2C12成肌细胞分化,改善Dex对C2C12成肌细胞的分化的抑制作用,还可逆转Dex诱导的C2C12肌小管萎缩。机制研究表明苦参碱可通过抑制E3泛素连接酶和上调MyoD表达减轻骨骼肌蛋白的降解。信号通路研究表明,苦参碱上调C2C12肌小管中Akt、mTOR和FoxO3α的磷酸化水平,而PI3K特异性抑制剂wortmanin可减弱苦参碱对上述信号蛋白的调节作用,并上调E3泛素连接酶表达。表明苦参碱调控肌萎缩与Akt/mTOR/FoxO3α信号通路有关。3.Dex、TNFα和CT26培养基上清均可导致C2C12肌小管中BDK低表达。敲减BDK也可抑制C2C12成肌细胞的分化、诱导肌小管萎缩,这与肌小管肌生成相关蛋白MyoD、MyoG表达水平下降,E3泛素连接酶表达上调有关。而BDK过表达对C2C12肌小管的作用则与BDK敲减相反,并且BDK过表达可部分逆转Dex诱导的C2C12肌小管萎缩。机制研究表明BDK可调控C2C12肌小管中Akt/mTOR/FoxO3α信号通路。4.动物实验研究表明CT26肿瘤恶病质小鼠骨骼肌中BDK表达也显著降低。敲减BDK可引起小鼠腓肠肌质量减轻和肌纤维尺寸减小,同时MuRF1的表达上调、MyoD表达下调。BDK过表达则呈现相反作用。另外,BDK过表达也可改善CT26肿瘤恶病质小鼠骨骼肌萎缩。信号通路分析表明,BDK可上调Akt和mTOR的磷酸化水平。5.苦参碱可上调恶病质小鼠腓肠肌和萎缩的肌小管中BDK mRNA表达。腓肠肌中BDK敲减导致苦参碱保存恶病质小鼠肌纤维尺寸和肌蛋白作用减弱。此外,C2C12肌小管BDK敲减后,苦参碱对Dex诱导的肌小管萎缩逆转作用减弱、促进肌蛋白合成和Akt及mTOR磷酸化作用减弱。结论:苦参碱可改善CT26肿瘤恶病质症状,并且这种作用主要与保存骨骼肌质量相关。作用特征分析表明,苦参碱一方面可抑制E3泛素连接酶表达而降低骨骼肌蛋白降解,另一方面可促进C2C12成肌细胞分化,改善肌小管萎缩,提高PI3K/Akt信号通路中的关键蛋白Akt、mTOR和FoxO3α磷酸化水平,改善骨骼肌蛋白合成。进一步机制研究表明BDK基因在骨骼肌萎缩中扮演重要的角色,肌萎缩可导致BDK表达下调;敲减BDK可降低骨骼肌质量,引起骨骼肌萎缩。而过表达BDK可改善恶病质所致骨骼肌萎缩。苦参碱可通过调控BDK表达增加骨骼肌质量和肌纤维尺寸,其机制与增加MyoD表达及Akt、mTOR等蛋白磷酸化水平促进骨骼肌蛋白合成,抑制E3泛素化连接酶表达改善肌蛋白降解相关。