【摘 要】
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目的:肥胖、营养过剩/失衡引起的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是全球范围内的高发性肝脏疾病,且发病率持续上升。目前尚缺乏理想的NAFLD治疗药物。肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell,LSEC）窗孔丢失和功能失调所引起的肝窦毛细血管化改变是NAFLD发生发展的独立危险因素,但LSEC毛
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目的:肥胖、营养过剩/失衡引起的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是全球范围内的高发性肝脏疾病,且发病率持续上升。目前尚缺乏理想的NAFLD治疗药物。肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell,LSEC）窗孔丢失和功能失调所引起的肝窦毛细血管化改变是NAFLD发生发展的独立危险因素,但LSEC毛细血管化改变的具体机制不清楚。肝细胞外泌体在NAFLD等慢性肝病的发生发展中发挥重要作用。本研究旨在探究脂毒性损伤肝细胞来源的外泌体（lipotoxic hepatocytes derived exosome,LTH-ex）调控LSEC毛细血管化促进NAFLD的作用及机制,为NAFLD的治疗提供新的靶点。方法:（1）分离、培养人肝细胞系LO2,LO2与油酸和棕榈酸混合物（OPA）共培养24h,采用尼罗红染色观察LO2脂肪变性,制备脂毒性损伤肝细胞（lipotoxic hepatocytes,LTH）。（2）采用超速离心法提取LO2外泌体（LO2 derived exosome,LO2-ex）和脂毒性损伤肝细胞外泌体（lipotoxic hepatocytes derived exosome,LTH-ex）。通过纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）检测LO2-ex和LTH-ex的粒径大小和颗粒数量,并利用透射电子显微镜（TEM）观察LO2-ex和LTH-ex的结构和形态。Western blot和流式细胞仪技术检测LO2-ex和LTH-ex外泌体标志蛋白CD9、CD63、Alix、TSG101、CD81和Calnexin的表达。（3）分别将LO2-ex和LTH-ex与LSEC共培养24h,观察LO2-ex和LTH-ex对LSEC毛细血管化的影响,检测毛细血管化标志物的表达、内皮细胞舒张功能障碍、内皮细胞血管生成能力和内皮细胞窗孔的丢失情况。（4）Western blot、实时荧光定量PCR和细胞免疫荧光染色检测LO2经脂毒性诱导前后N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（Olinked N-Acetylglucosamine transferase,OGT）的蛋白表达水平。用CM-DIL标记LO2-ex和LTH-ex,激光共聚焦显微镜观察LO2-ex和LTH-ex在LSEC内的分布。Western blot检测LO2-ex和LTH-ex中OGT的蛋白表达水平,及LO2-ex和LTH-ex处理后的LSEC的OGT蛋白表达和O连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-Linked N-Acetylglucosamine,O-GLc NAc）修饰水平,细胞免疫荧光染色检测O-GLc NAc和促血管生成素2（angiopoietin 2,Ang-2）共定位。（5）诱导LSEC的O-GLc NAc修饰,通过Western blot、细胞免疫荧光染色和血管生成实验验证O-GLc NAc修饰水平升高对肝窦内皮细胞毛细血管化的影响。（6）构建高脂饮食（high-fat diet,HFD）诱导的NAFLD小鼠模型,尾静脉注射LO2-ex和LTH-ex进行干预。通过HE染色、油红O染色、天狼星红染色、免疫组织荧光染色和酶联免疫吸附实验评估肝组织修复和损伤的效果,明确LO2-ex和LTH-ex在肝窦毛细血管化和NAFLD发生发展中的作用。结果:（1）脂毒性损伤后肝细胞外泌体释放增加,LO2-ex和LTH-ex具有外泌体的典型表征。（2）LO2-ex能够抑制LSEC成管、维持LSEC窗孔开放,而LTHex作用后LSEC成管能力增加和窗孔数量降低。（3）NAFLD小鼠经LTH-ex干预后,肝脏指数下降,体重、脂肪滴和胶原沉积增加,小鼠血清Ang-2水平增加,促血管生成素1（angiopoietin 1,Ang-1）水平下降,Ang-2与Ang-1比值增加。（4）脂毒性损伤后肝细胞OGT表达增加,LTH-ex中OGT富集,LTH-ex可以促进LSEC的OGT表达和蛋白O-GLc NAc修饰。（5）诱导O-GLc NAc修饰可以促进LSEC中的Ang-2表达和体外血管生成。结论:脂毒性损伤肝细胞释放的外泌体可能通过转运OGT,促进LSEC的OGLc NAc修饰,增强LSEC毛细血管化和推动NAFLD进展。
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