【摘 要】
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目的:在前期研究工作的基础上,通过尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立脓毒症大鼠模型,观察不同剂量化瘀方对脓毒症大鼠血清炎症因子及外周淋巴细胞免疫功能的调控作用及对TLR4基因、蛋白表达的干预作用,观察化瘀方对脓毒症大鼠免疫系统保护的作用机制,为临床治疗脓毒症提供新的思路和方法。方法:1、实验动物造模。（1）动物:六周龄SPF级雄性Wistar大鼠（2）数量分组:共
【基金项目】
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重大危急医疗事件中西医协调平台（LH02.68.011）；
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目的:在前期研究工作的基础上,通过尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立脓毒症大鼠模型,观察不同剂量化瘀方对脓毒症大鼠血清炎症因子及外周淋巴细胞免疫功能的调控作用及对TLR4基因、蛋白表达的干预作用,观察化瘀方对脓毒症大鼠免疫系统保护的作用机制,为临床治疗脓毒症提供新的思路和方法。方法:1、实验动物造模。（1）动物:六周龄SPF级雄性Wistar大鼠（2）数量分组:共50只,随机分为空白组、模型组、中药高、中、低剂量预处理组,每组10只。（3）中药组成:丹参30g、大黄15g,分别浓煎至1g/ml、0.5g/ml和0.25g/ml。（4）造模前预处理:空白组与模型组予生理盐水灌胃2ml/日,中药高、中、低组按预设浓度予中药灌胃2ml/日。共灌胃7日。（5）造模:模型组和中药各组采取尾静脉注射法,注射LPS（剂量为6 mg/kg）,空白组尾静脉注射等剂量生理盐水。造模前与造模后第3h、第6h测大鼠肛温,造模6h后取其脾脏标本保存。2、酶联免疫吸附（ELISA）检测大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6水平的变化。3、HE染色法观察各组大鼠脾脏病理学变化。4、流式细胞仪检测大鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞数量。5、半定量逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测脾脏细胞TLR4基因表达。Western印迹法检测脾脏TLR4蛋白表达。结果:1.动物造模后一般情况观察:与空白组大鼠相比,模型组大鼠和中药组大鼠都出现了进食饮水减少,精神不振,反应迟钝,部分出现腹泻、呼吸频率加快,个别处于濒死状态等情况。总的来讲,中药组大鼠的精神反应活动要优于模型组,中药组高剂量组优于中、低剂量组。与空白组比较,模型组大鼠注射LPS3h、6h后体温都显著降低,其差异有统计学意义（P＜0.01）;与模型组比较,中药组大鼠注射LPS3h、6h后体温明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。中药各剂量组之间比较,体温有升高趋势,但差异不明显（P＞0.05）。2.各组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6水平检测结果显示:与空白组比较,模型组明显升高,有统计学意义（P＜0.01）;与模型组比较,中药各剂量组明显降低,有统计学意义（P＜0.01）;与中药低剂量组相比,中、高剂量组降低,其中高剂量组降低较明显,有统计学意义（P＜0.01）。证明中药化瘀方可以下调脓毒症大鼠的炎症反应水平,以高剂量组作用最为明显。3.各组大鼠脾脏组织病理学改变:空白组大鼠脾脏被膜光滑,细胞无充血水肿,红白髓结构清晰。脓毒症模型组大鼠脾窦扩张充血,内皮细胞水肿,巨噬细胞增多,淋巴小结结构破坏,脾细胞固缩凋亡。中药组大鼠脾脏损伤情况相比模型组大鼠减轻,其中高剂量组减轻尤为明显。4.各组大鼠脾脏组织CD4+、CD8+T细胞检测结果显示:与空白组相比,模型组大鼠脾脏细胞CD4+T的水平明显降低,CD8+T增高,CD4+/CD8+比值有所降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与模型组相比,中药组大鼠脾脏CD4+T增高,CD8+T降低,CD4+/CD8+比例升高,有统计学意义（P＜0.01）;中药各组相比,高剂量组大鼠脾脏CD4+T增高,CD8+T降低,CD4+/CD8+比例升高尤为明显,差异具有统计学意义（P＜0.01）。5.各组大鼠脾脏TLR4基因、蛋白检测结果显示:与空白组TLR4基因与TLR4蛋白的水平相比,模型组明显升高,有统计学意义（P＜0.01）;与模型组相比,中药组大鼠脾脏TLR4基因与TLR4蛋白的水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。中药高、中、低剂量组相比,高剂量组大鼠脾脏TLR4基因与蛋白的水平降低最为明显,差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论:1、通过向大鼠尾静脉直接注射LPS的方法建立脓毒症动物模型简单可靠,与脓毒症发生时的剧烈炎症反应和脾脏细胞损伤的严重程度高度契合,对研究治疗脓毒症所采取炎症抑制和免疫调节机制研究较为合适。2、化瘀方灌胃预处理可以减少脓毒症大鼠炎症因子TNF-α、IL-6的释放,减轻脓毒症大鼠炎症反应。3、化瘀方中药灌胃预处理可以提高脾脏CD4+/CD8+的比例。调节脓毒症大鼠的免疫功能,并减轻脓毒症大鼠脾脏的损伤。4、化瘀方中药可能通过降低脓毒症大鼠TLR4基因、蛋白的表达,减轻脓毒症带来过度炎症反应,减轻脓毒症大鼠脾脏损伤,改善其免疫功能。
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