葡萄油菜素甾醇合成关键酶基因VvDET2的克隆及相关基因干旱胁迫表达分析

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油菜素甾醇(Brassinosteroids,BRs)是一类重要的甾醇类激素,对植物生长发育和抗逆功能发挥重要作用。本试验以欧亚种(Vitis vinifera L.)酿酒葡萄品种赤霞珠(Cabernet Sauvignon)为试材,分析了油菜甾醇(campesterol,CR)、油菜烷醇(campestanol,CN)、栗甾酮(castasterone,CS)、油菜素内酯(brassinolide,BL)含量及相关合成基因DET2、DWF1、CPD、BR6ox1在葡萄中的时空特异性表达模式;进一步分析了EBR预处理和干旱胁迫对葡萄幼苗叶片BRs合成的影响;并克隆获得了葡萄Vv DET2基因全长序列,在线分析了Vv DET2基因的生物学功能。试验初步分析了Vv DET2基因在葡萄生长发育和干旱胁迫过程中的时空表达模式和调控作用,为进一步研究BRs介导葡萄生长发育的整体调控模式提供理论基础。主要结论如下:(1)BRs种类和含量在葡萄不同组织器官中存在显著差异,合成下游有生理活性的BRs(CS和BL)在葡萄地上部叶片、卷须以及未成熟种子中含量较高,合成上游无生理活性的BRs(CN和CR)在成熟种子、茎以及地下部根系中含量较高。BRs生物合成基因也存在不同的时空特异性表达模式,DET2、DWF1和BR6ox1基因在葡萄叶片和卷须等地上部分营养器官中表达量较高,BR6ox1在根中也有较高表达,而DET2、DWF1和CPD基因在根中表达量较低,CPD基因主要在种子中表达。(2)克隆了酿酒葡萄赤霞珠DET2基因的c DNA序列,并推导出编码氨基酸序列,基因片段大小为774 bp,编码257个氨基酸。分析发现与葡萄Vv DET2蛋白亲缘关系最近的是松果菊,而亲缘关系最远的是梅花和碧桃。葡萄的Vv DET2蛋白具有PEMT家族的保守结构域,推测Vv DET2蛋白主要参与植物BRs生物合成的第二步反应,特征性催化BRs合成前体的5-α还原过程。通过在线网址分析Vv DET2蛋白属于疏水性非分泌型膜蛋白。(3)外源24-epibrassinolide(EBR)处理可以缓解干旱胁迫对葡萄叶片相对含水量的降低,并缓解干旱胁迫对PSⅡ最大荧光效率的抑制;外源EBR可缓解干旱胁迫对CR、CN和CS水平的抑制作用,维持植株内源BRs含量的稳定。与对照(CK)相比,DET2、DWF1、CPD和BR6ox1四种基因表达量均受干旱胁迫下调,外源EBR预处理可有效缓解干旱胁迫对DET2基因转录水平的抑制,对DWF1和CPD基因表达量缓解作用不明显。
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