论文部分内容阅读
目的:课题组已有研究表明,肥胖和2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）个体血清中miR-548ag的表达水平显著升高,且与受试者血糖水平显著正相关,miR-548ag可上调二肽基肽酶4（Dipeptidyl Peptidase-4,DPP4）的表达,抑制肝细胞葡萄糖消耗。但miR-548ag促进DPP4表达的具体分子机制尚不明确。本研究在构建饮食诱导的肥胖小鼠模型,以及体外培养人肝细胞系L02和人肝癌细胞系HepG2的基础上,明确miR-548ag是否通过TLR（7/8）/NF-κB信号通路促进肝细胞DPP4的表达,诱发胰岛素抵抗（Insulin Resistant,IR）和T2DM,为预防和治疗T2DM提供新的理论依据和作用靶点。方法:（1）高脂饮食饲养雄性C57BL/6小鼠（n=8）构建肥胖模型,普通饮食饲养小鼠（n=8）设为对照,每周记录小鼠体重及Lee’s指数,于22周检测小鼠空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）及血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA含量,收集小鼠血清、附睾白色脂肪组织及肝脏组织检测miR-548ag的表达水平,Western-blot检测小鼠肝脏组织中TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白及DPP4的蛋白表达水平。（2）体外培养HepG2及L02细胞,分别进行以下处理:转染miR-548ag mimic和inhibitor、转染TLR7和TLR8干扰片段、以及过表达miR-548ag的同时分别抑制TLR7/8,Western-blot检测TLR7/8、NF-κB通路相关因子及DPP4的蛋白表达水平,运用葡萄糖氧化酶法检测细胞上清葡萄糖浓度。（3）4周龄雄性C57BL/6小鼠分为ND饲养组（n=16）及HFD饲养组（n=16）,饲养16周后,将ND饲养组分为PBS处理对照组（n=8）及腹腔注射miR-548ag过表达腺病毒载体组(n=8,腹腔注射量为1×1011VP/只,每周注射1次),将HFD饲养组分为PBS处理对照组（n=8）及腹腔注射miR-548ag抑制剂腺病毒载体组(n=8,腹腔注射量为1×1011VP/只,每周注射1次),每周检测并记录小鼠体重及Lee’s指数。持续腹腔注射6周,运用IPGTT及ITT实验评价小鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性。试剂盒检测小鼠FBG及血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C及FFA含量;q RT-PCR检测小鼠血清及肝脏组织miR-548ag表达水平;Western-blot检测TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白及DPP4的蛋白表达水平。（4）选用4周龄雄性C57BL/6糖尿病小鼠（db/db鼠）（n=12）,经过1周适应性喂养,分为腹腔注射空载腺病毒载体组（n=6,每周注射1次）和腹腔注射miR-548ag抑制剂腺病毒载体组(n=6,腹腔注射量为1×1011VP/只,每周注射1次),每周检测并记录小鼠体重及Lee’s指数。持续腹腔注射6周后,运用IPGTT及ITT实验评价小鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性。收集小鼠血清、各部位脂肪组织及肝脏,检测小鼠FBG及血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C及FFA含量;q RT-PCR检测小鼠血清及肝脏miR-548ag的表达水平;Western-blot检测TLR7/8、NF-κB通路相关因子及DPP4的蛋白表达水平。（5）构建脂肪组织特异性Dicer基因敲除小鼠（n=6）,以野生型（WT）小鼠为对照（n=6）,高脂饮食饲养12周检测小鼠体重、Lee’s指数及FBG水平。收集小鼠血清、白色脂肪及肝脏组织,检测miR-548ag的表达水平,检测白色脂肪组织Dicer的m RNA表达水平。（6）实验数据运用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据检测呈正态分布且方差齐则进行t检验分析,若数据检测呈非正态分布则进行非参数秩和检验分析,P＜0.05认为差异有统计学意义。结果:1.肥胖小鼠血清、附睾白色脂肪组织及肝脏miR-548ag含量增加,并且肝脏组织中TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白及DPP4表达增加。（1）60%的高脂饮食饲养雄性C57BL/6小鼠至22周,与普通饮食饲养组相比,高脂饮食组小鼠体重及Lee’s指数显著增加（P＜0.05）;且小鼠肝脏及各部位脂肪组织（Epi、Sub、PAT及MAT）重量、FBG以及血清中TG、TC、LDL-C及FFA含量显著高于普通饮食组（P＜0.05）。提示饮食诱导的肥胖小鼠模型构建成功。（2）60%的高脂饮食饲养雄性C57BL/6小鼠至22周,与普通饮食饲养组相比,小鼠血清、附睾白色脂肪组织及肝脏组织miR-548ag的表达水平显著增加（P＜0.05）;小鼠肝脏组织中TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平增加。2.miR-548ag可上调TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白及DPP4的表达,抑制肝细胞的葡萄糖消耗能力。（1）在HepG2及L02细胞中分别转染50n M的miR-548ag mimic 24h后,与对照组相比,细胞中miR-548ag、TLR7、TLR8及DPP4的m RNA表达水平显著增高（P＜0.05）;且肝细胞TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平增加;细胞葡萄糖消耗能力显著降低（P＜0.01）。（2）在HepG2及L02细胞中分别转染75nM的miR-548ag inhibitor 24h后,与对照组相比,细胞中TLR7、TLR8及DPP4的m RNA表达水平显著减少（P＜0.05）;且肝细胞TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平降低;细胞葡萄糖消耗能力显著增强（P＜0.01）。3.抑制TLR7/8,可逆转miR-548ag对肝细胞NF-κB通路关键蛋白、DPP4表达水平的促进作用,以及对肝细胞葡萄糖消耗能力的抑制作用。（1）在HepG2及L02细胞中分别转染80nM的TLR7/8干扰片段24h后,与对照组相比,TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平降低,细胞葡萄糖消耗能力显著增强（P＜0.01）。（2）在HepG2及L02细胞中,与对照组相比,上调miR-548ag可显著促进TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4蛋白表达水平,抑制细胞的葡萄糖消耗能力;与单纯上调miR-548ag组相比,上调miR548-ag的同时分别干扰TLR7/8,显著逆转了miR-548ag对肝细胞TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4蛋白表达水平的促进作用,以及对细胞葡萄糖消耗能力的抑制作用。4.miR-548ag可上调肝脏组织中TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白及DPP4的表达,并抑制小鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性。（1）持续6周给予普通饮食饲养小鼠腹腔注射miR-548ag过表达腺病毒载体,与空载组相比,小鼠体重、肝脏及各部位脂肪组织（eWAT、Sub WAT、pr WAT及MAT）重量显著增加（P＜0.05）;血清及肝脏组织中miR-548ag的表达水平显著增加（P＜0.01）;肝脏组织中TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平升高。（2）持续6周给予普通饮食饲养小鼠腹腔注射miR-548ag过表达腺病毒载体,与空载组相比,小鼠FBG水平显著增加,葡萄糖耐量及胰岛素敏感性显著降低（P＜0.05）;血清TC、TG、LDL-C、FFA含量显著增加（P＜0.05）。（3）持续6周给予高脂饮食饲养小鼠腹腔注射miR-548ag抑制剂腺病毒载体,与空载组相比,小鼠体重、肝脏及各部位脂肪组织（eWAT、Sub WAT、pr WAT及MAT）重量显著降低（P＜0.01）;小鼠肝脏组织中TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平降低。（4）持续给予高脂饮食喂养小鼠腹腔注射miR-548ag抑制剂腺病毒载体6周后,与对照组相比,小鼠FBG显著降低,葡萄糖耐受能力及胰岛素敏感性显著增加（P＜0.05）;血清TC、TG、LDL-C及FFA含量显著降低（P＜0.05）。5.miR-548ag抑制剂可下调db/db小鼠肝脏组织TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白及DPP4的表达,改善小鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性。（1）持续给予db/db小鼠腹腔注射miR-548ag抑制剂腺病毒载体6周后,与对照组相比,小鼠体重、Lee’s指数、肝脏及各部位脂肪组织（e WAT、Sub WAT、pr WAT及MAT）重量显著降低（P＜0.05）;小鼠肝脏组织TLR7/TLR8/My D88/p-p65/p-IκB/DPP4的蛋白表达水平降低。（2）持续给予db/db小鼠腹腔注射miR-548ag抑制剂腺病毒载体6周后,与对照组相比,小鼠FBG、TG、TC、LDL-C含量显著降低（P＜0.05）;葡萄糖耐量及胰岛素敏感性显著改善（P＜0.05）。6.miR-548ag主要来源于脂肪组织构建特异性脂肪组织敲除Dicer基因小鼠（Dicer KO）模型,高脂饮食饲养至12周后,以野生型小鼠（WT）为对照,Dicer KO组小鼠附睾白色脂肪组织Dicer的m RNA表达水平显著降低（P＜0.01）,小鼠体重、Lee’s指数及FBG无显著改变,血清、白色脂肪组织及肝脏组织miR-548ag的表达水平显著降低（P＜0.01）。结论:肥胖后,脂肪组织源性的miR-548ag含量增加,通过上调肝细胞TLR7/8、NF-κB通路关键蛋白促进DPP4表达,最终导致糖代谢紊乱。