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溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是引起海水养殖动物细菌性疾病的主要病原菌之一,经常给水产养殖业造成巨大的经济损失。溶藻弧菌III型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）是其重要的致病系统。T3SS是保守的注射装置,可插入宿主细胞膜把毒力蛋白注入细胞内,导致细胞死亡。在T3SS注射毒力蛋白过程中,针尖的转位子蛋白Vop B、Vop D和Vcr V先在宿主细胞膜上成孔是致病的前提,但它们在溶藻弧菌致病性中的作用尚不清楚。因此,本研究利用同源重组技术,构建溶藻弧菌的缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV,研究各缺失株的生物学特性和致病力,并通过转录组、蛋白质组和代谢组关联分析,探讨溶藻弧菌转位子基因vopB、vopD和vcrV的功能。主要结果如下:1.转位子基因vopB、vopD和vcrV的克隆及缺失株ΔvopB、ΔvopD、vopBD和ΔvcrV的构建克隆vopB、vopD和vcrV基因并进行生物信息学分析,结果显示,各基因的碱基序列长度分别为1 200 bp、1 005 bp和1 824 bp,3个基因的氨基酸序列均与魔鬼弧菌和副溶血弧菌聚为一支。用同源重组技术成功构建缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV。遗传稳定性检测显示,各缺失株遗传稳定。2.缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV的生物学特性研究缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV的生物学研究显示,各缺失株的生长、自凝集能力和胞外酶活性无显著变化。各缺失株的游动和涌动能力均增强,而毒力、细胞粘附力和抗氧化能力均减弱。缺失株ΔvopB和ΔvopD的生物膜形成能力增强,而ΔvopB-D和ΔvcrV则减弱。缺失株ΔvopB、ΔvopD和ΔvopB-D的耐盐和耐重金属能力均增强,ΔvcrV的耐盐性减弱。除ΔvopB的葡萄糖不变和ΔvcrV的活性氧降低外,各缺失株的活性氧、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、β-内酰胺酶、肽聚糖、还原型辅酶Ⅱ、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、ATP、葡萄糖指标均升高。ΔvopB和ΔvopD对喹诺酮类和β-内酰胺类的头孢唑林与头孢哌酮敏感性减弱,ΔvopB对头孢氨苄敏感性增强,ΔvopD对头孢呋辛敏感性增强。ΔvopB-D除部分青霉素类和喹诺酮类外,对大多数药物敏感性均增强。ΔvcrV对部分β-内酰胺类的头孢类敏感性增强,对喹诺酮类敏感性减弱。缺失株ΔvopB、ΔvopB-D和ΔvcrV的鞭毛相关基因fla B、fli G和耐药相关基因omp U、emr D、vem D、CARB-6、pbp1a/2、dac A表达均上调。ΔvopD的鞭毛相关基因fla B、fla G、fli G和耐药相关基因omp U、CARB-6表达上调,而fli G、emr D、vem D、pbp1a/2则下调。表明vopB、vopD和vcrV基因参与溶藻弧菌T3SS的致病性和多种生理功能,具有重要的生物学意义。3.缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV对斑马鱼免疫效果分析用低浓度的缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV肌肉注射免疫斑马鱼,获得的免疫保护率分别为52.9%、70.5%、82.4%、64.7%。ΔvopB和ΔvopD免疫组均下调斑马鱼肝脏免疫蛋白Ig M、C3a基因,炎症因子TNF-α、TLR5、IL-6R、IL-6、IL-8、IL-1β、C/EPBβ基因,抗氧化酶Sod1、Cat1、Gpx1a、GSTR基因及溶菌酶Lyz基因。ΔvopB-D免疫组仅Ig M基因表达上调,其他免疫和抗氧化相关基因均下调。ΔvcrV免疫组IL-1β和C3a基因表达不变,其他免疫和抗氧化相关基因均下调。斑马鱼肝脏生化及酶活指标显示,各免疫组的Ig M、GPX和MDA指标均升高。其中ΔvopB免疫组的IL-6、TNF-α、SOD、GST、LZM指标降低;ΔvopD免疫组的TNF-α、SOD、GST、CAT指标降低,C3a、LZM指标升高;ΔvopB-D免疫组的IL-6、TNF-α指标降低,SOD、GST、CAT指标升高;ΔvcrV免疫组的IL-6、CAT、LZM指标降低,C3a、SOD、GST指标升高。表明各缺失株免疫斑马鱼影响了其免疫和抗氧化系统。4.vopB、vopD和vcrV对耐药、抗氧化和运动等相关基因的调控对缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D、ΔvcrV进行转录组、蛋白质组和代谢组检测显示,各缺失株的差异基因分别为2 618、2 053、1 578、1 557个;差异蛋白分别为335、250、283、545个;差异代谢物分别为32、49、77、70个。组学关联分析显示,转位子基因vopB、vopD和vcrV的缺失,主要影响溶藻弧菌的β-内酰胺耐药性、细菌运动与鞭毛组装、抗氧化系统、肽聚糖代谢、氨基酸代谢、抗生素合成、T2SS和T6SS等相关基因的表达。