【摘 要】
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研究背景与目的阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii,T.asahii）是一种机会性致病真菌,常引发伴中性粒细胞减少的癌症患者及其他免疫功能缺陷入群发生侵袭性真菌感染,即便接受抗真菌治疗,患者死亡率仍在50%以上。遗憾的是,目前人们对阿萨希毛孢子菌相关分子机制,如致病机制、耐药机制及宿主内进化机制等了解甚微。我们于临床中发现一例慢性阿萨希毛孢子菌感染患者,病史长达14年,并相继从该
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:81571972）；
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研究背景与目的阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii,T.asahii）是一种机会性致病真菌,常引发伴中性粒细胞减少的癌症患者及其他免疫功能缺陷入群发生侵袭性真菌感染,即便接受抗真菌治疗,患者死亡率仍在50%以上。遗憾的是,目前人们对阿萨希毛孢子菌相关分子机制,如致病机制、耐药机制及宿主内进化机制等了解甚微。我们于临床中发现一例慢性阿萨希毛孢子菌感染患者,病史长达14年,并相继从该患者面部皮损中分离出原代菌株AS2.2174与复发菌株BM1403。本例罕见的慢性持续性真菌感染患者,为我们研究阿萨希毛孢子菌在宿主内进化机制提供了独特优势。方法1.蛋白质组学分析:采用TMT（Tandem Mass Tags）标记联合高效液相色谱串联质谱技术比较阿萨希毛孢子菌AS2.2174与BM1403蛋白质组学的差异表达;差异倍数≥1.2或≤0.83,P<0.05的蛋白质评定为显著差异表达蛋白;利用GO数据库与KEGG数据库对差异蛋白进行生物信息学分析。2质谱多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）分析:基于差异蛋白生信分析结果选取靶标蛋白并对其进行MRM质谱分析,将MRM质谱分析与TMT定量结果进行关联性分析,确定变化一致的靶标蛋白。3.表型研究:通过温度生长实验,黑色素生成实验,巴龙霉素实验以及生物膜形成实验,揭示阿萨希毛孢子菌生理特征及毒力因子在宿主内的适应性改变。结果1.蛋白质组学分析:本研究共鉴定到显著差异蛋白597个,其中上调蛋白293个,下调蛋白304个。生物信息学分析结果表明,差异蛋白主要参与能量产生,蛋白质代谢与合成,药物代谢,氧化应激等重要生物学过程与途径。2.MRM质谱分析:基于差异蛋白是否参与关键的生物学过程（耐药等）或与某些表型的发生密切关联（毒力表型等）,我们选取了 27个靶标蛋白进行MRM分析,结果显示,21个靶标蛋白的表达丰度在MRM和TMT定量分析中呈现出一致的变化趋势。3.表型研究:温度生长实验结果显示,30℃培养48h,BM1403生长情况与AS2.2174相似,而在37℃和39℃时,与AS2.2174相比,BM1403表现出更好的生长态势;黑素生成实验结果显示,在含L-DOPA的固体及液体培养基中培养一定时间后,BM1403黑色素产量高于AS2.2174;巴龙霉素实验结果显示,40ug巴龙霉素滤纸片存在下,可直观观察到菌株BM1403抑菌圈直径小于AS2.2174;激光共聚焦扫描显微镜观察阿萨希成熟生物膜（48h）,BM1403生物膜厚度高于AS2.2174（58.83±2.79μm vs 48.67±4.50μm,P<0.05）。同时,与 AS2.2174 相比,BM1403拥有更高的丝化程度。结论1.经宿主体内进化后,阿萨希毛孢子蛋白质组学发生显著变化,差异蛋白广泛参与多种不同的生物学过程及途径。2.MRM对候选靶标蛋白验证分析结果表明,MRM质谱分析与TMT标记定量存在可靠的关联性。3.BM1403菌株可能通过提升其高温耐受能力,黑素生成能力,蛋白翻译效率及生物膜形成等过程,以维持其能够在宿主体内长久生存。
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