研究背景:人们每天都暴露在辐射中,包括自然环境的辐射和人为环境的辐射,产生众多生物学效应,例如细胞的氧化应激,DNA损伤等。O~6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O~6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）属于DNA损伤修复酶,作为一种DNA甲基转移酶,能将O~6-甲基鸟嘌呤上的烷基转移到自身氨基酸残基上,使DNA链上的鸟嘌呤得以复原。MGMT的表达受多种表观调控因子的影响,包括micro RNA、DNA甲基化、组蛋白甲基化等。现在已经确定MGMT启动子甲基化状态是脑胶质母细胞瘤治疗预后的生物标志物之一。DNA启动子甲基化通过影响转录因子与启动子的结合,从而影响基因的表达。现如今大多数研究集中在MGMT启动子甲基化状态与脑胶质瘤患者预后的关系研究,而转录因子对MGMT的表达调控研究少见报道。早期生长反应因子1（Early growth response factor 1,EGR1）是一种重要的转录因子,主要参与组织损伤、免疫应答和纤维化的过程。近年来的研究表明,EGR1与肿瘤的发生发展密切相关,可能参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和肿瘤血管生成等。例如,EGR1可以与SNAIL协同作用于MMP9和ZEB1的启动子区域,从而增强它们的转录并启动肿瘤细胞的侵袭和转移。同时,有研究发现,在EGR1高表达的患者中MGMT基因启动子区域DNA甲基化的频率高于EGR1低表达的患者。目前,EGR1与MGMT基因之间的相互作用尚不明确。研究目的:观察MGMT基因在不同细胞系中的表达情况及MGMT启动子区域甲基化水平与辐射后细胞增殖与存活的关系,并探讨EGR1对MGMT的调控机制,为脑胶质瘤临床治疗新靶点的寻找提供实验依据,为脑胶质瘤辐射后效应的研究提供理论依据。研究方法:1.通过Gepia生物信息学网站分析脑胶质瘤患者MGMT表达量与生存期的关系,及多种肿瘤与癌旁组织中EGR1的表达情况;2.通过TF-target网站分析MGMT基因启动子区域的转录因子结合位点;3.通过BSP克隆测序分析MGMT基因启动子甲基化水平;4.克隆形成实验检测辐射对细胞克隆形成能力的影响;5.q-PCR法和Weston Blot法检测MGMT、EGR1、EZH2、TGF-β1、Smad、p-Smad等蛋白的表达情况;6.利用瞬时转染的方法将EGR1过表达质粒和si RNA转染至U87和U251细胞中,构建EGR1过表达和敲低的细胞模型;采用q-PCR和Western Blot方法验证模型建立成功与否;7.荧光素酶报告基因检测实验检测EGR1是否结合到MGMT的启动子区域;8.通过TGF-β1/Smad通路抑制剂处理细胞,观察TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达变化及其对EGR1表达的影响。研究结果:1.Gepia数据库分析MGMT基因与患者生存的关系通过Gepia数据库分析了MGMT基因表达与患者预后的相关性以及MGMT基因启动子区域甲基化程度与患者预后的相关性。分析结果显示,MGMT基因相对表达量较低和启动子甲基化率≥10%的患者较MGMT基因相对表达量较高和启动子甲基化率小于10%的患者,生存时间更长,生存率更高,经统计学检验分析P＜0.05,差异具有显著性。2.MGMT在A549、Hela、U87和U251细胞中的表达及启动子甲基化情况利用q-PCR和Western Blot法检测A549、Hela、U87和U251四种细胞系中MGMT基因的m RNA和蛋白表达情况。结果显示,U251细胞MGMT基因m RNA表达量最高,U87细胞MGMT基因m RNA表达量最低;A549细胞中蛋白表达最高,U87细胞中最低。随后,我们利用Meth Primer网站预测了MGMT基因启动子区域的Cp G岛,并利用BSP克隆测序法检测A549、Hela、U87和U251四种细胞系中MGMT基因启动子区域的甲基化程度。结果显示,U87细胞MGMT基因启动子甲基化程度最高,U251细胞MGMT基因启动子甲基化程度最低。这说明MGMT基因启动子区域甲基化程度影响MGMT基因的表达,甲基化程度越高,MGMT基因的相对表达量越低,甲基化程度越低,MGMT基因的相对表达量越高。3.辐射对A549、Hela、U87和U251细胞增殖和存活的影响利用克隆形成实验检测0、2、4、6和8Gy X射线辐射后,观察A549、Hela、U87和U251四种细胞克隆形成能力的变化,并使用单击多靶模型分析细胞存活曲线拟合的情况,结果显示,Hela细胞D0值最大,U87细胞D0值最小,说明Hela细胞放射敏感性最小,U87细胞放射敏感性最大;U251细胞Dq值最大,U87细胞Dq值最小,说明U251细胞损伤修复能力最强,U87细胞修复能力最弱。这说明MGMT相对表达量较高的细胞系,辐射对其细胞克隆形成能力的影响较弱,MGMT相对表达量较低的细胞系,辐射对其克隆形成能力的影响较大。4.多种肿瘤细胞中EGR1与EZH2的表达我们利用Gepia数据库分析不同肿瘤及癌旁组织中EGR1和EZH2的表达。结果显示,在GBM中EGR1和EZH2的表达都显著高于癌旁组织。我们利用q-PCR、Western Blot法检测A549、Hela、U87和U251四种细胞系中EGR1基因的m RNA与蛋白相对表达情况。结果显示,U251细胞中EGR1基因m RNA与蛋白相对表达量最高,U87细胞相对表达量最低;同样,U251细胞中EZH2基因m RNA相对表达量最高,U87细胞相对表达量最低。5.照射后EGR1与MGMT的表达变化U87和U251细胞在经过6和8 Gy X射线照射后,细胞中EGR1 m RNA和蛋白的表达与未经照射组相比均显著增加;U87细胞MGMT基因m RNA显著增加,U251细胞m RNA表达水平无显著变化,但U87和U251细胞MGMT的蛋白表达显著增加。6.TGF-β1/Smad/EGR1对MGMT表达的调控机制我们通过TF-target网站对MGMT基因启动子区域的转录结合位点进行了分析,发现在MGMT基因启动子区域有EGR1的结合位点,提示我们EGR1可能通过调控MGMT基因的转录,影响MGMT基因的表达。我们将EGR1过表达质粒转入U87和U251细胞中,即建立EGR1过表达的两种细胞模型,结果显示,U87和U251细胞EGR1过表达后,MGMT基因m RNA和蛋白表达水平均升高;向U251细胞中转染si RNA,即建立EGR1敲低的细胞模型,MGMT基因m RNA和蛋白表达水平均降低。另外,使用荧光素酶报告基因检测,发现EGR1与MGMT启动子区域的直接结合调控MGMT的表达。我们又使用TGF-β1/Smad通路抑制剂SB431542处理细胞,6h后通过Western Blot法检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达变化情况。结果显示,U87和U251细胞相关蛋白表达变化情况基本一致,与空白对照组相比,6Gy照射组EGR1和p-Smad蛋白表达均显著增加,随通路抑制剂剂量的增加EGR1和p-Smad蛋白表达水平逐渐降低;同时,6Gy照射组TGF-β1和Smad蛋白表达显著增加,随通路抑制剂剂量的增加TGF-β1和Smad蛋白表达水平基本不变;结果提示辐射可通过TGF-β1/Smad通路影响EGR1的表达。研究结论:1.MGMT启动子区域甲基化程度可能影响MGMT基因表达水平,并与细胞的辐射敏感性相关;2.辐射可以诱导EGR1和MGMT表达水平显著增加,且二者之间存在明显的正相关;3.辐射可以通过TGF-β1/Smad/EGR1通路调控MGMT的表达。