【摘 要】
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DNA甲基化是重要的表观遗传学调控机制之一,在多种生物学过程中发挥作用。部分甲基Cp G结合结构域蛋白(Methyl-Cp G-binding domain protein,MBD)可识别甲基化DNA,参与植物的应激和生长发育。茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]为多年生常绿木本植物,一个世代会多次经历各种逆境胁迫。课题组前期对CsMBD家族基因进行鉴定和分析,发现一
【基金项目】
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国家自然科学基金(31972461,32172632); 浙江省“十四五”育种专项茶树协作组项目(2021C02067-2); 财政部和农业农村部:国家现代农业(茶叶)产业技术体系绿茶品种改良岗位(CARS-19); 基本业务费专项(Y2021PT07);
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DNA甲基化是重要的表观遗传学调控机制之一,在多种生物学过程中发挥作用。部分甲基Cp G结合结构域蛋白(Methyl-Cp G-binding domain protein,MBD)可识别甲基化DNA,参与植物的应激和生长发育。茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]为多年生常绿木本植物,一个世代会多次经历各种逆境胁迫。课题组前期对CsMBD家族基因进行鉴定和分析,发现一个与逆境胁迫和芽休眠解除调控密切相关的基因CsMBD8。为进一步明确该基因行使功能的分子机制,本研究筛选及鉴定CsMBD8互作蛋白,研究结果将为深入阐明CsMBD8的功能和作用机制提供了重要依据,也为揭示茶树表观遗传调控机理奠定坚实基础。主要研究结果如下:(1)CsMBD8可以形成同源和异源二聚体。本研究构建了CsMBD8-P2YN和CsMBD8-P2YC载体,以空载为对照,利用双分子荧光互补技术,在烟草表皮细胞中证实了CsMBD8自身存在同源二聚体;与12个已克隆的茶树CsMBDs基因互作验证结果显示,CsMBD8与12个茶树CsMBDs家族成员间均存在相互作用,可以形成异源二聚体。(2)CsMBD8与CsIDMs(Increased DNA Methylation)存在直接互作,且部分CsIDMs及CsMBDs成员间也存在复杂的相互作用。拟南芥研究证实IDM是可以与MBD蛋白互作的一类DNA甲基化调控因子。基于同源分析在茶树品种‘龙井43’中鉴定并克隆了3个CsIDM基因,其中CsIDM1属组蛋白乙酰转移酶家族,CsIDM2、CsIDM3均属于热激蛋白家族。表达分析表明CsIDMs受非生物及生物胁迫诱导,其中CsIDM1在茶树越冬芽休眠形成与解除过程中表达模式与CsMBD8相似。双分子荧光互补实验表明CsMBD8与3个CsIDMs间均存在相互作用,酵母双杂进一步证实了CsMBD8和CsIDM1两者之间存在直接互作;研究还发现CsIDM2与CsIDM3间同样存在互作,且分别与CsMBD5/16互作。(3)经茶树酵母双杂文库筛选和双分子荧光互补验证,发掘了4个与CsMBD8互作的未知蛋白CsMIP1-4。利用前期已构建的茶树腋芽等多组织三框c DNA酵母双杂文库,对CsMBD8的未知互作蛋白进行了筛选,最终对10个筛选蛋白编码基因进行了全长克隆和互作验证。双分子荧光互补实验表明CsMBD8与其中的4个未知蛋白CsMIP1/2/3/4存在直接互作。基因的特性分析发现,CsMIP1/2/3/4均为酸性亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,定位于细胞核中。在组织表达、花器官发育、种子萌发、芽休眠调控、生物胁迫和非生物胁迫响应中具有特异性。以上研究结果表明:茶树CsMBD8可以形成同源和异源二聚体;在参与DNA甲基化调控中,CsMBD8可能需要CsIDMs共同作用;此外,CsMBD8还可能与核定位的CsMIP1/2/3/4等存在直接互作,共同参与茶树逆境胁迫和芽休眠解除等生物学过程的调控。
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