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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属于无患子科（Sapindaceae）龙眼属（Dimocarpus Lour）中重要的热带亚热带名贵果树,因其富含酚类等次生代谢物质,具有较高的食用及药用价值。龙眼果实品质与胚胎发育完善程度息息相关,赖钟雄等建立的龙眼体胚发生模式实验体系为研究龙眼胚胎发育提供了良好的研究平台。此前生长素信号转导通路中重要调控蛋白跨膜激酶（TMK）主要在拟南芥中进行研究,发现TMK可与丝裂原活化蛋白激酶激酶（MKK）协同调控植株根系细胞分裂。目前,在龙眼中尚未见到TMK及MKK基因家族的报道。因此,本研究基于本实验室破译的‘红核子’龙眼二代/三代基因组数据库及转录组数据,进行DlTMK与DlMKK基因家族鉴定及生物信息学分析;检测DlTMKs与DlMKKs在龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的表达;通过si RNA干扰处理验证DlTMK1-2与DlMKK4的生物学功能;参考第三代龙眼基因组数据库克隆了DlTMK1-2与DlMKK4两个基因,构建了GUS与GFP两种融合表达载体,分别进行了瞬时转化及亚细胞定位分析;最后,通过在拟南芥中过表达DlTMK1-2与DlMKK4,由此验证两个基因的生物学功能。主要研究结果如下:1龙眼DlTMK与DlMKK基因家族鉴定及表达模式分析DlTMK基因家族由6个家族成员组成,均为具有跨膜结构但不具有信号肽的亲水性蛋白;进化方式与拟南芥、杨树相近;6个成员随机分布在五条染色体上,DlTMK1-1与DlTMK1-2属于串联重复;且拥有激素、逆境胁迫及生长发育相关的多种启动子顺式作用元件。DlTMKs在体胚发生早期三个阶段表达与转录组数据基本一致。通过分析DlTMKs在生长素、赤霉素及脱落酸三种激素处理下的表达模式,发现DlTMKs响应这三种激素,表达变化趋势因处理不同存在差异。DlMKK基因家族中共鉴定出6个家族成员,均为不具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;随机分布在5条染色体上;进化方式与杨树甜橙相近;具有激素、逆境胁迫及生长发育等多种启动子顺式作用元件;通过预测DlMKK家族成员蛋白互作情况,发现其与多种蛋白发生交互作用;在体胚发生早期三个阶段的表达与转录组基本一致。结合顺式作用元件结果,采用生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯及水杨酸五种激素进行处理,发现DlMKK家族成员响应这5种激素,各成员表达趋势与处理相关。2 DlTMK1-2及DlMKK4在龙眼体胚发生早期功能分析当siRNA抑制DlTMK1-2基因表达后,龙眼体胚发生早期进程受到了抑制;DlMKK4基因被下调表达后,与DlTMK1-2被抑制时相比,促进了龙眼体胚发生,说明DlTMK1-2基因可促进龙眼体胚发生。通过测定DlTMK1-2及DlMKK4被抑制后龙眼体胚中生长素含量及龙眼体胚发生早期三个阶段转录组数据进行分析,发现生长素含量变化趋势与基因表达变化趋势一致,推测DlTMK1-2及DlMKK4参与龙眼体胚发生早期生长素信号调控机制。通过克隆验证及构建p CAMBIA1301-DlTMK1-2-GUS、p CAMBIA1301-DlMKK4-GUS农杆菌融合表达载体,利用农杆菌介导法将构建好的载体转入龙眼愈伤组织中。通过测定DlTMK1-2基因在DlMKK4-OE1中的表达及DlMKK4基因在DlTMK1-2-OE1中的表达,推测DlTMK1-2与DlMKK4具有相互调控作用。3龙眼DlTMK1-2及DlMKK4亚细胞定位研究通过无缝克隆技术构建p CAMBIA1302-DlTMK1-2-GFP及p CAMBIA1302-DlMKK4-GFP农杆菌融合表达载体,利用注射法将两个载体转入野生型烟草叶片,采用激光扫描共聚焦显微镜观察烟草叶片下表皮的荧光分布情况。发现DlTMK1-2定位在细胞质及细胞膜中,DlMKK4定位在细胞膜上,与在线网站预测结果基本一致。4龙眼DlTMK1-2及DlMKK4基因转化野生型拟南芥过表达分析为进一步验证DlTMK1-2及DlMKK4在植物体胚发生中的作用,利用浸花法将构建好的p CAMBIA1301-DlTMK1-2-GUS、p CAMBIA1301-DlMKK4-GUS农杆菌融合表达载体转入野生型拟南芥中,利用潮霉素及GUS染色对T1代阳性植株进行筛选,利用潮霉素对T2代进行筛选,发现阳性植株比例在90%以上。对不同时期WT及EV2、DlTMK1-2-OE2、DlMKK4-OE2植株表型进行观察,发现在15d时DlTMK1-2-OE2、DlMKK4-OE2植株根系短于WT;培养33d、55d及果荚成熟期进行观察,发现DlTMK1-2-OE2、DlMKK4-OE2植株长势要比另外两个株系好且快,果荚数量均显著多于WT,由此推测DlTMK1-2、DlMKK4在植株发育的不同阶段参与的调控机制不同。同样通过测定四个株系中的生长素含量,发现DlTMK1-2-OE2、DlMKK4-OE2植株生长素含量显著高于WT及EV2,由此再次验证了DlTMK1-2、DlMKK4参与生长素信号调控。