【摘 要】
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龙眼（Dimocarpus longan L.）是无患子科龙眼属的亚热带果树,经济价值高,种植广泛。本课题组前期通过对‘四季蜜’龙眼和普通龙眼‘立冬本’成年树回缩新梢进行miRNA高通量测序,发现novel-miR137在‘四季蜜’中表达量下调,在‘立冬本’中上调,而novel-miR37在‘四季蜜’中表达量上调,‘立冬本’中下调,推测这两个novel miRNA可能与‘四季蜜’龙眼连续开花特性有
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龙眼（Dimocarpus longan L.）是无患子科龙眼属的亚热带果树,经济价值高,种植广泛。本课题组前期通过对‘四季蜜’龙眼和普通龙眼‘立冬本’成年树回缩新梢进行miRNA高通量测序,发现novel-miR137在‘四季蜜’中表达量下调,在‘立冬本’中上调,而novel-miR37在‘四季蜜’中表达量上调,‘立冬本’中下调,推测这两个novel miRNA可能与‘四季蜜’龙眼连续开花特性有关。本课题通过在拟南芥中过表达novel miRNA,初步研究龙眼novel-miR137（Dl-novel-miR137）、novel-miR37（Dl-novel-miR37）的功能。同时,为了更好地进行龙眼成花基因的功能研究,以龙眼实生幼苗为试验材料,利用TRV-GFP病毒载体,设计不同侵染方式,建立了龙眼VIGS体系。主要研究内容如下:1、验证了Dl-novel-miR137的功能。本实验克隆Dl-novel-miR137的前体序列,成功构建重组质粒p SAK277-MIR137,农杆菌稳定转化拟南芥,抗性筛选培养获得了4个转基因拟南芥株系,DNA验证结果均为阳性,经过筛选培养获得纯合转基因拟南芥。与野生型对比,4个株系的纯合转基因拟南芥均表现出莲座叶数目增加,延迟开花的现象,且Dl-novel-miR137在转基因拟南芥中有较高的表达水平,这与前期在龙眼中的推测结果一致,表明Dl-novel-miR137参与调控植物开花过程,且高水平的表达会抑制开花。利用在线网站预测并筛选Dl-novel-miR137在拟南芥中的两个开花相关的潜在基因At SCL11和At PRR7,发现转基因拟南芥中At SCL11和At PRR7表达水平显著低于野生型,推测Dl-novel-miR137在拟南芥中很可能通过靶向At SCL11和At PRR7从不同的途径参与拟南芥的成花过程;构建SCL11与GUS基因的融合载体,通过烟草瞬时共转化实验证明Dl-novel-miR137与At SCL11存在靶向关系,进一步阐明Dl-novel-miR137调控植物开花的机理;通过对Dl-novel-miR137在龙眼中靶基因的预测和分析,推测Dl-novel-miR137可能通过靶向Dl SCL9、Dl JUB1、Dl TMK1从赤霉素途径和生长素信号转导方面调控龙眼成花。2、验证了龙眼Dl-novel-miR37的功能。利用前期构建的p SAK277-MIR37重组质粒,通过农杆菌转化拟南芥,获得了4个转基因拟南芥株系,DNA验证结果均为阳性,经过筛选培养获得纯合转基因拟南芥。研究发现,Dl-novel-miR37的表达量越高,拟南芥开花时间越早,说明Dl-novel-miR37在拟南芥中的过量表达推动了拟南芥早花现象的发生,这与前期在龙眼中的预测结果一致。转基因拟南芥在长日照条件下Dl-novel-miR37相对表达量最高是野生型的80倍,但是在短日照条件下Dl-novel-miR37的表达量可以高达424倍,推测Dl-novel-miR37在拟南芥中的表达可能受到光周期的诱导;在MIR37转基因拟南芥中,随着Dl-novel-miR37的过量表达,它的潜在靶基因At PRP39的表达量是明显下降的,二者存在负调控关系,猜测Dl-novel-miR37通过抑制PRP39的表达从自主开花途径调控拟南芥发生早花现象;成功构建At PRP39与GUS基因的融合载体,通过烟草瞬时共转化实验证明Dl-novel-miR37能够负调控At PRP39的表达;预测并分析Dl-novel-miR37在龙眼中靶基因,推测Dl-novel-miR37调控龙眼的FAR1基因通过光信号传导调控龙眼开花。3、以龙眼实生幼苗为试验材料,利用带有GFP的TRV病毒载体,设计伤口包被、压迫注射、侵染液水培、真空渗透等方法侵染龙眼幼苗,结果显示真空渗透方法效果最佳。真空渗透处理侵染后7-10天,龙眼叶片出现有绿色荧光表达;侵染后45天,植株抽生的新叶片观察到有点状绿色荧光出现,RT-PCR验证结果表明,龙眼幼苗中存在TRV病毒的表达,建立了龙眼VIGS侵染体系。
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