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卵形鲳鲹作为我国南方沿海地区一种重要的海水养殖鱼类,其面临养殖环境恶化和病害频发的挑战。鉴定和研究卵形鲳鲹免疫相关分子,将有助于制定病害防控新策略。TAK1是MAP3K家族中的重要成员;TAB1和TAB2是TAK1的结合蛋白。TAK1与TAB1结合引起TAK1磷酸化,而与TAB2结合及泛素作用后导致TAK1泛素化。TAK1发生磷酸化和泛素化而具有激酶活性,可激活NF-κB和MAPKs信号通路,影响机体先天免疫、适应性免疫、细胞分化、组织修复和自身免疫性炎症等生命活动过程。本研究应用分子生物学技术和生物信息学的方法,获得了卵形鲳鲹TAK1(TroTAK1)、TroTAB1和TroTAB2基因的c DNA全长、解析基因结构与功能、探讨进化与同源关系;检测3个基因m RNA在健康卵形鲳鲹组织中的表达情况;分析LPS、poly I:C与溶藻弧菌刺激后3个基因m RNA在免疫相关组织中的应答规律;构建原核表达载体,进行重组蛋白的表达与纯化。所取得的主要研究成果如下:1、获得TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因的cDNA全长分别为2429bp、2067 bp和4229 bp,预测其开放阅读框分别为1728 bp、1521 bp和2280bp,分别推定编码575、506和759个氨基酸。蛋白结构预测发现TroTAK1蛋白氨基端具有一个S＿TKc结构域,羧基端存在一个CCR结构域;TroTAB1蛋白羧基端具有一个PP2C＿SIG结构域;TroTAB2蛋白具有三个结构域分别为CUE结构域、Zn F结构域和CCR结构域。同源性分析显示3个基因氨基酸序列与其他鱼类的同源性较高,分别为95.7-97.9%、92.1-96.4%和87.1-98.0%;进化树上的物种分为鱼类、爬行类、哺乳类和鸟类四枝,TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2蛋白都分别与鱼类聚为一枝。以上结果表明TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因为其他脊椎动物TAK1、TAB1和TAB2基因的同源物,并在鱼类中高度保守。2、实时荧光定量PCR检测发现TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因在健康卵形鲳鲹鳃、脑、心脏、头肾、肌肉、肝脏、脾脏和肠均有表达,但表达水平不同。其中,TroTAK1在肝脏中表达量最高,脑中表达量次之;TroTAB1在脾脏中表达量最高,心脏中表达量次之;TroTAB2在肠中的表达水平最高,肝脏中表达次之;3个基因均在肌肉中表达水平最低。这些结果说明TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2参与了卵形鲳鲹基本的生命活动。3、LPS、polyI:C和溶藻弧菌刺激后3个基因的免疫应答:(1)LPS刺激后,在头肾、脾脏、肝脏和鳃组织中,TroTAK1基因的表达量在刺激后6h时间点无显著升高,在12和24 h表达量则显著上调,随后降低,在48 h表达量虽上调,但差异不显著。在头肾和脾脏中,TroTAB1基因表达水平在刺激后12和24 h显著上升;在肝脏中,除12和24 h时间点显著上升外,在48 h也显著上升;而鳃中仅在12 h检测到表达水平的显著上调。在脾脏中,TroTAB2基因表达量于刺激后6、12和24 h时间点显著上调;而在鳃、肝脏和头肾中表达水平分别在6、12和24 h时间点到达最高值,随后逐渐降低。(2)poly I:C刺激后第6和12 h,头肾中TroTAK1表达量显著上调;TroTAK1在肝脏和鳃中表达模式相似,均在6 h上升,12 h达到峰值;脾脏中TroTAK1表达水平在6和24 h时间点显著上调。TroTAB1基因在头肾、肝脏和鳃中表达模式类似,均在24 h显著上升,在6、12和48 h时间点上升但差异不显著;而脾脏中的表达水平在12 h显著上升,在24 h达到最大值。在肝脏和脾脏中,TroTAB2基因表达量在刺激后12和24 h均显著上调;而在头肾和鳃中仅12 h时间点检测到表达水平的显著上升。(3)溶藻弧菌刺激后,肝脏中TroTAK1基因表达量在0 h后的各检测时间点显著上调;在脾脏和鳃中表达模式类似,表达量均在刺激后12 h达到峰值,随后下降,48 h时间点已无显著上调;而头肾中表达量在刺激后12和24 h显著上调。TroTAB1在肝脏、鳃和脾脏中6 h时间点表达量上升,12 h到达峰值,随后下降,48 h时间点已无显著上调;而头肾中仅在刺激后24 h检测到TroTAB1表达量的显著上调。TroTAB2基因在肝脏和鳃中表达量在刺激后12 h到达峰值;脾脏中TroTAB2基因表达量在刺激后6、12和24 h显著上调;而在头肾中仅在24 h检测到表达量显著上升。以上结果表明TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因参与了卵形鲳鲹抵御细菌和病毒感染的先天免疫过程。4、构建TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因原核表达载体,诱导表达了TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2重组蛋白。纯化了上述3个基因的重组蛋白,对表达的蛋白进行Western blot检测。结果获得了纯化后的重组蛋白,为后续蛋白功能研究和抗体制备奠定了基础。