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研究背景:DNA碱基主要包含胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）,DNA碱基损伤普遍存在肿瘤细胞内,损伤因子主要包括活性氧（reactive oxygen species,ROS）、氧化剂、烷化剂及紫外线照射,其中DNA氧化损伤最为频繁。由于鸟嘌呤的8号位碳原子极易受到氧化攻击而形成的8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxo-7,8-dihydroguanine,8-oxo-G）,因此8-oxo-G是胞内最多的氧化损伤碱基[1]。碱基切除修复（Base Excision Repair,BER）是一种修复细胞DNA氧化损伤的高度保守机制,BER通路中包含有三十多种蛋白[2]。其中8-氧鸟嘌呤糖基化酶（8-oxoguanine DNA glycosylase,OGG1）识别并切除8-oxo-G形成脱嘌呤脱嘧啶位点（apurinic-apyrimidinic site,AP）,然后AP核酸内切酶（apurinic/apyrimidinic endonuclease1,APE1）结合并募集下游修复酶对AP位点进行间接切除修复,并通过DNA聚合酶β（DNA polymerase beta,DNA polβ）恢复其正确的碱基配对[3,4]。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要亚型[5,6],表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）靶向治疗目前有效应用于驱动突变阳性患者,然而在晚期转移性非小细胞肺癌中,患者相继出现耐药并且发生肿瘤转移复发。上皮-间充质细胞转化（Epithelial-mesnchymal transition,EMT）和肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）是癌症耐药重要的原因。EMT是通过表观遗传修饰、转录调控、可变剪切和蛋白质亚细胞定位等不同层面调节,期间有2000-3000个基因表达发生改变[7]。CSCs是肿瘤内最难治疗的一个癌细胞亚群,具有自我更新和DNA损伤抗性的能力,可以维持原发性和继发性肿瘤生长。CSCs有很强的参与DNA修复的基因和蛋白质激活网络系统,因此肿瘤干细胞转化是除了EGFR基因二次突变（T790M突变）和EMT之外导致EGFR-TKI耐药的重要原因[8,9]。EMT和CSCs之间也存在密切的联系[10,11]。APE1是BER通路的关键限速酶,是具有核酸内切酶和氧化还原双功能蛋白酶,OGG1同样是双功能酶[2]。由于AP和8-oxo-G位点分别为APE1和OGG1酶底物,所以我们默认APE1和OGG1在基因组上富集区域代表AP位点和8-oxo-G位点分布。BER蛋白已被证明具有超越DNA修复的作用,在表观遗传中有新的发现。APE1对非B型DNA结构的修复活性减弱导致基因组中存在碱基损伤“热点区域”,8-oxo-G位点亦呈现非随机分布的特点。8-oxo-G/AP位点在全基因组中可以稳定的存在并且呈现出非随机分布的特征。结合大量文献报道APE1和OGG1与肿瘤的复发转移及耐药相关。本研究主要目的是为探索8-oxo-G/AP位点作为一种新型表观遗传标志物在全基因中的分布规律,APE1和OGG1蛋白在修复碱基损伤位点（8-oxo-G/AP位点）的同时偶联基因表达调控,这种双功能特征可能通过表观遗传重编程调控EMT和CSCs相关基因的异常表达促进癌细胞对EGFR-TKI治疗的抵抗。研究方法:1.用Western Blot实验验证APE1抗体和OGG1抗体与A549细胞表达的APE1蛋白和OGG1蛋白高效且特异性的相结合。2.用琼脂糖凝胶电泳技术检测染色质被超声破碎成200bp-1500bp长度的DNA片段是否满足ChIP-seq要求,即60%DNA片段在200bp-1500bp范围内;5%聚丙烯酰胺凝胶电泳,用超高灵敏金染核酸染料（Invitrogen,S11494,美国）进行核酸染色显示APE1、阳性、2%input与阴性对照IP样本在200bp-1500bp之间位置比较有明显的核酸条带,以此来验证Ch IP-seq实验体系是否成功。3.用Ch IP-seq实验技术来获取A549细胞中与APE1和OGG1蛋白特异性结合的AP位点和8-oxo-G位点邻近的DNA片段,并用Ch IP-PCR技术验证整个实验体系的可靠性。4.生物信息学分析Ch IP-seq数据,使用MACS2（version 2.1.0）峰值调用软件来识别背景IP富集的区域。所有数据集的q值阈值均为0.05。峰值调出后的染色体分布、峰宽、褶丰度、显著性水平和每个峰峰数的分布均得到了显示,使用Homer软件检测全新序列模体和已知匹配模体,Ch IPseeker可以确认峰相关基因,然后进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析,使用KOBAS软件检测了KEGG通路峰相关基因的统计富集性。5.用GEO数据库和ENCODE数据挖掘组蛋白H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3和H3K36me3的Ch IP-seq数据和本实验APE1和OGG1蛋白Ch IP-seq数据比对分析,以此来探索8-oxo-G/AP位点可能是表观遗传标志物分子。6.用低浓度梯度诱导的方法诱导获得性EGFR-TKI耐药株HCC827ER和PC9ER,并在显微镜下观察细胞形态的变化,用transwell检测耐药株侵袭能力的变化,细胞活力检测实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）来检测敏感株和耐药株erlotinib的IC50数值,验证稳定培养的耐药株。用Western Blot实验检测敏感株和耐药株的BER、EMT和CSCs相关标志物蛋白的表达改变。7.有限稀释法来分选不同克隆亚型的耐药株亚群,并用全外显子测序的方法和一代测序的方法来验证分选的单克隆细胞株是否为T790M突变型细胞株。8.用慢病毒感染实验来沉默和过表达敏感株PC9、HCC827细胞和耐药株PC9ER和HCC827ER细胞的APE1和OGG1基因,并用Western Blot实验验证APE1和OGG1蛋白的表达量是否达到实验要求。9.用RNA-seq数据筛选EGFR-TKI耐药株与敏感株之间的基因表达差异,并通过差异分析和GSEA基因集富集分析筛选出EMT和CSCs通路相关基因。10.利用CUT＆Tag技术获得APE1、OGG1和BG4在HCC827和HCC827ER细胞基因组中的富集区域信息。11.PC9ER＿APE1＿Ch IP-seq数据挖掘靶基因P21、MYC、KRAS、TMBIM6、POTEH、ANKRD30BL、GUSBP1上的显著富集峰的序列,设计序列引物,然后比对耐药株和敏感株靶基因上APE1结合区域富集差异。研究结果:1.针对BER通路蛋白APE1和OGG1的免疫染色质沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验技术体系成功构建。2.APE1和OGG1在全基因组广泛分布并且非随机性位于基因调控区域,APE1和OGG1分布于启动子区比例分别为41.7%和49.26%。3.APE1与OGG1结合模体高度匹配细胞生长、周期、癌症、转录激活和抑制的转录因子,APE1相关motif最佳匹配转录因子是Dof2、TCP19、ZNF165、PLAGL1、CDC5,OGG1相关的motif最佳匹配转录因子是MBNL1、CAMTA1、E2F1、ZFP161、GT-1。4.APE1和OGG1结合峰相关基因与癌症通路密切相关。5.APE1和OGG1蛋白与表观遗传标志物组蛋白在全基因组上结合区域部分重叠。6.APE1和OGG1在非小细胞肺癌细胞EGFR-TKI耐药中均上调,耐药株相对于敏感株细胞形态发生改变,耐药株细胞形态变成类似于间充质细胞的梭形,细胞侵袭能力增强,耐药株PC9ER和HCC827ER的erlotinib的IC50值比敏感株均提高了10倍以上,过表达敏感株的APE1和OGG1基因后,敏感株对erlotinib的IC50值增大,敲低耐药株中的APE1和OGG1之后,耐药株对erlotinib的IC50值减小。7.肺癌细胞EGFR-TKI耐药与EMT和CSCs显著相关,HCC827在耐药中EMT和CSCs标志物分子Vimentin、CD44、c-Myc、FGF2升高而E-cadherin、Oct-4A、Nanog、Sox2、KLF4、P21、P16和EGFR降低,PC9在耐药中EMT和CSCs标志物分子Vimentin、CD44降低而E-cadherin、Oct-4A、Nanog、Sox2、KLF4、c-Myc、P21、P16和EGFR升高。APE1在PC9耐药中对P21、MYC、KRAS、TMBIM6、POTEH、ANKRD30BL、GUSBP1基因的启动子区富集度增高。8.APE1和OGG1可通过结合新型表观遗传标志物8-oxo-G/AP位点调控EMT及CSCs参与EGFR-TKI耐药机制,过表达敏感株中的APE1和OGG1基因能促进EMT和CSCs分子水平向耐药株转变,而敲低耐药株APE1和OGG1能恢复耐药株对erlotinib的敏感性及EMT和CSCs分子部分逆转到敏感株水平。研究结论:1.BER通路蛋白APE1和OGG1在全基因组中非随机性分布且主要位于基因调控区域。AP位点和8-oxo-G位点分别为APE1和OGG1的催化底物,根据酶底物特异性,我们推断8-oxo-G/AP位点分布呈非随机性且位于基因调控区。2.APE1和OGG1结合的motif高度匹配癌症相关基因转录因子;APE1和OGG1结合峰相关基因与癌症显著相关并且与表观遗传修饰组蛋白在全基因组上结合区域部分重叠,因此推断DNA的氧化性碱基损伤位点8-oxo-G/AP作为新型表观遗传标志物参与肿瘤的基因调控。3.APE1和OGG1的高表达促进肺癌细胞PC9和HCC827的EGFR-TKI耐药,APE1和OGG1可能是通过表观遗传调控机制影响肿瘤细胞的EMT、CSCs和老化等相关基因集的表达来调控耐药。根据以上结论,我们推测DNA碱基损伤位点8-oxo-G/AP作为新型表观遗传标志物参与了肺癌细胞EGFR-TKI耐药进程中的基因表达调控。