研究背景及目的恶性淋巴瘤（malignant lymphoma,ML）是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤。近年,我国ML发病率逐年上升,现已成为威胁人类健康的常见肿瘤之一。ML分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类。T淋巴母细胞淋巴瘤（T-cell lymphoblastic lymphoma,T-LBL）是一种罕见的高危侵袭性前体淋巴母细胞来源的肿瘤,占所有非霍奇金淋巴瘤的1%-2%,主要侵犯淋巴结,常累及纵隔与骨髓。T-LBL进展速度快、恶性程度高,传统非霍奇金样化疗方案效果差,治疗后极易复发,其高危亚型早期前体T淋巴母细胞淋巴瘤（early T-cell precursor lymphoblastic lymphoma,ETP-LBL）长期生存率仅为 19%。因此,T-LBL急需更好的治疗策略。为了建立有效的靶向治疗方案,提高患者的疾病缓解率与生存率,深入探讨该疾病的分子发病机制很有必要。近年来,高通量分子测序技术的应用使研究T-LBL疾病发生发展相关的分子生物学改变成为可能。全外显子测序针对外显子区域进行DNA捕捉并富集后分析,可以精确地剖析疾病相关的特定基因表型及其在疾病中的作用。已有文献报道NOTCH-1信号通路、表观遗传调节因子、甲基化、非编码RNA等的改变部分或共同参与了 T-LBL疾病的发生与发展。其中,细胞周期失控在T-LBL发病机制中起关键作用。在T细胞成熟的早期,细胞周期调节的紊乱导致前体T淋巴细胞发育停滞。细胞周期依赖性激酶抑制因子2A/2B（Cyclin-dependent ki nase inhibitor 2A/2B,CDKN2A/2B）和视网膜母细胞瘤基因（Retinoblastoma,RB1）等细胞周期相关分子已被证实在T-LBL中存在重要变异。本研究通过对41例T-LBL患者的肿瘤组织及配对正常组织进行全外显子测序,新发现T-LBL组织中存在细胞分化周期蛋白27（cell division cycle protein 27,CDC27）基因突变,且CDC27突变与患者预后相关。泛素连接酶是细胞周期调控系统的核心成分及关键调控分子。后期促进复合物/环状体（anaphase Promoting complex/cyclosome,APC/C）是最重要的泛素连接酶之一,而CDC27是APC/C的核心成分。在正常有丝分裂中,CDC27与其他蛋白之间的相互作用可抑制底物与APC/C结合,从而调节有丝分裂的时间。此外,APC/C还参与调控基因组稳定性、细胞分化、自噬、死亡以及能量代谢等多种生物学过程,而这些与肿瘤发生发展相关的功能多由APC/C中的CDC27亚基调节。已有相关研究报道,CDC27在肿瘤患者中可存在DNA、mRNA以及蛋白水平上的变异,从而影响肿瘤患者的发病、生存以及预后等。然而,CDC27在淋巴瘤中的作用目前仍不清楚。T-LBL与细胞周期相关基因的异常有着密切的关系,而CDC27又是细胞周期中的核心调控因子。因此,CDC27有可能是影响T-LBL患者疾病发生发展的一个关键靶点。本课题第一部分通过全外显子测序首次发现了 T-LBL预后相关的突变基因CDC27,分析了CDC27在T-LBL患者组织中表达情况及与临床特征、预后的相关性;第二部分通过相关生物学功能实验验证CDC27对T-LBL细胞株增殖、凋亡、周期、迁移等的影响;利用转录组学技术,发现下游信号通路CDC27/p-STAT5/PD-L1轴并进行验证;第三部分通过构建T-LBL皮下移植瘤模型,干扰表达CDC27或过表达CDC27联合通路抑制剂以验证CDC27在T-LBL中的体内功能和作用机制。本课题通过探讨CDC27在T-LBL中的作用及机制,为T-LBL个体化靶向治疗奠定理论基础。下面就各个部分的研究方法、结果和本研究的结论报告如下。第一部分 CDC27在T淋巴母细胞淋巴瘤中的突变、表达及临床参数分析研究方法1.对41例T-LBL患者肿瘤组织及配对外周血进行全外显子测序。使用突变显著性检测工具MuSiC以识别潜在的驱动突变基因。2.Western blot检测CDC27在正常T细胞以及T-LBL各细胞株（Jurkat、Sup-t1、Molt-3、CCRF-CEM、HPB-ALL和CUT-LL1）中蛋白表达水平。3.收集121例T-LBL患者肿瘤组织和60例淋巴结反应增生组织蜡块,利用免疫组化法进行CDC27蛋白在各种组织中表达的检测,并用免疫反应积分法（immunoreactive score,IRS）进行评估。4.使用Pearson χ2检验分析CDC27表达与T-LBL患者的临床特点之间的相关性。5.生存分析采用Kaplan-Meier方法分析。CDC27突变及表达高低等与T-LBL患者总生存期（overall survival,OS）以及无病生存期（progression-free survival,PFS）的相关性采用log-rank检验分析。为确定影响OS和PFS的预后因素,采用Cox比例风险回归模型进行分析。研究结果1.新发现了突变基因CDC27,突变率为12.2%,且CDC27突变的患者,具有更差的OS（P=0.023）和PFS（P=0.014）。2.CDC27基因突变的患者,CDC27蛋白高表达。CDC27基因突变患者的CDC27蛋白表达IRS评分高于野生患者（P=0.028）。3.与正常T细胞相比,CDC27在T-LBL细胞株Jurkat、Sup-t1、Molt-3和CCRF-CEM、HPB-ALL和CUT-LL1中的蛋白质表达量升高。4.T-LBL患者肿瘤组织中的CDC27蛋白表达水平明显高于淋巴结反应性增生组织（P＜0.001）。5.CDC27高表达组和CDC27低表达组在Ann Arbor临床分期上的差别具有统计学意义（P=0.001）。6.CDC27 高表达组具有更差的OS（P=0.001）、PFS（P=0.002）;CDC27 表达情况（P=0.001）、Ann Arbor临床分期（P=0.005）和ECOG评分（P=0.001）是影响OS的独立预后因素,CDC27表达情况（P=0.030）、Ann Arbor临床分期（P=0.004）是影响PFS的独立预后因素。小结1.CDC27基因在T-LBL患者中存在突变,且CDC27基因突变与不良预后有关。2.CDC27蛋白在T-LBL肿瘤组织中表达升高,CDC27高表达与较差的Ann Arbor分期以及不良预后有关。第二部分探究CDC27在T淋巴母细胞淋巴瘤中的功能及机制研究方法1.采用慢病毒转染的方式,对Sup-t1细胞进行CDC27过表达,对Jurkat细胞进行CDC27干扰表达;稳定传代培养后检测CDC27的表达量。2.CDC27对细胞生物学功能的检测包括:CCK8法、EdU流式细胞术、PI染色法流式细胞术、Annexin Ⅴ和7-AAD双染法、软琼脂克隆形成实验、Transwell小室。3.将干扰表达CDC27及对照组细胞收集后进行转录组学测序,得到两组的差异基因,进行相关通路的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,筛选验证CDC27可能影响的下游通路及关键基因。4.使用相关通路抑制剂作用于过表达CDC27的Sup-t1细胞株,验证其对功能的反向抑制作用以及关键通路蛋白的影响。5.通过双荧光素酶报告实验检测转录因子转录激活情况。6.使用免疫组化染色对30例患者肿瘤组织标本进行通路关键蛋白表达检测。研究结果1.沉默表达CDC27较对照组可使CCK8 450nm处吸光度值、EdU阳性率降低,细胞周期S期减少,凋亡率增加,克隆形成能力、细胞迁移能力降低;而过表达CDC27则较对照组可使CCK8 450nm处吸光度值、EdU阳性率增加,细胞周期S期升高,凋亡率降低,克隆形成能力、细胞迁移能力增加。P值均小于0.05。2.转录组学测序结果差异基因在白介素2（Interleukin-2,IL-2）/信号转导与转录因子 5（Transducers and activators of transcription 5,STAT5）stignaling pathway、E2F3 targets和Apoptosis等基因集中富集;采用Western blot对通路蛋白进行验证,在Jurkat细胞株中,沉默表达CDC27后,IL-2/STAT5通路关键蛋白p-STAT5表达减少,E2F3基因集中周期促进蛋白表达减少,凋亡蛋白表达增加;在CDC27过表达的Sup-t1 CDC27 OE组中,p-STAT5表达增加,周期促进蛋白表达增加,凋亡蛋白表达减少。P值均小于0.05。3.STAT5抑制剂Pimozide作用后,Sup-t1 CDC27 OE细胞株较不加药组相比,通路活化关键蛋白p-STAT5的表达显著减少,CCK8吸光度值下降,EdU的阳性率下降,细胞周期S期减少,凋亡率增加。P值均小于0.05。4.在GSEA分析的结果中,差异基因在程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1,PD-1）signaling pathway基因集中富集;该通路差异基因表达量聚类热图分析结果显示,shCDC27组较shNC对照组程序性细胞死亡蛋白-1配体（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）的表达差异最为显著;Western blot和免疫荧光实验结果显示,沉默表达CDC27可在蛋白水平降低PD-L1的表达,而过表达CDC27则增加PD-L1的表达。P值均小于0.05。5.双荧光素酶报告基因检测实验结果发现STAT5可以与PD-L1的启动子区结合并增强其活性（P＜0.001）。6.Sup-t1 CDC27 OE过表达细胞株中加入STAT5抑制剂能够显著削弱CDC27对PD-L1表达的促进作用（P=0.018）。7.30例T-LBL患者标本免疫组化及IRS结果显示,CDC27高表达组相对于CDC27低表达组的p-STAT5评分（P=0.023）和PD-L1评分（P=0.019）均较高。小结1.CDC27可通过激活STAT5促进T-LBL细胞株增殖、细胞周期进展、细胞克隆形成能力、细胞迁移能力,减少细胞凋亡,并可被STAT5抑制剂逆转。2.CDC27在T-LBL肿瘤细胞中可通过激活STAT5调控PD-L1表达。第三部分 体内动物实验验证CDC27在T淋巴母细胞淋巴瘤中的功能及机制研究方法1.动物实验一:使用稳定敲低CDC27的Jurkat CDC27 sh1组（5只）及对照Jurkat CDC27 shNC组（5只）,构建T-LBL裸鼠皮下移植瘤模型。2.动物实验二:使用稳定过表达CDC27基因的Sup-t1细胞株以及所对应的对照组细胞株,待T-LBL小鼠模型构建成功后,将Sup-t1 CDC27 OE组随即分为两组,加药Sup-t1 CDC27 OE/Pimozide组每天给Pimozide（10 mg/kg/day）（5 只）至实验结束。Sup-t1 CDC27 OE/Vehicle组（5只）和Sup-t1 CDC27 Vector/Vehicle组（5只）则给与等容量的安慰剂作为对照。3.接种后,每天观察小鼠一般状态。测量、绘制生长曲线。干预结束后,处死各组裸鼠,称量瘤重。4.将瘤体固定后进行石蜡包埋及切片,随后对各组进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色,使用免疫组化法进行增殖指数Ki67的检测,使用原位末端转移酶标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）进行凋亡的检测。5.使用免疫组化法对各组瘤体组织切片进行CDC27蛋白、p-STAT5蛋白和PD-L1蛋白的检测。研究结果1.动物实验一:Jurkat CDC27 sh1组较Jurkat CDC27 shNC组瘤体明显缩小（P=0.002）,瘤重减少（P=0.005）,Ki67阳性比例降低,TUNEL阳性细胞数增加,CDC27蛋白（P＜0.001）、p-STAT5蛋白（P=0.002）和PD-L1蛋白（P=0.003）表达降低。2.动物实验二:Sup-t1 CDC27 OE/Vehicle组较Sup-t1 CDC27Vector/Vehicle组的肿瘤体积明显增大（P=0.039）,瘤重增加（P=0.003）,Ki67阳性比例增加,TUNEL阳性细胞数减少,CDC27蛋白（P=0.004）、p-STAT5蛋白（P=0.011）和PD-L1蛋白（P=0.004）表达增加。3.动物实验二:给予Pimozide抑制剂后,Sup-t1 CDC27 OE/Vehicle组较Sup-t1 CDC27 OE/Vehicle组肿瘤体积明显减小（P＜0.001）,瘤重降低（P=0.003）,Ki67阳性比例降低,TUNEL阳性细胞数增加,p-STAT5蛋白（P＜0.001）和PD-L1蛋白（P＜0.001）表达水平降低。小结1.CDC27可促进T-LBL小鼠皮下肿瘤形成。2.STAT5抑制剂可逆转CDC27在T-LBL中的促瘤作用。3.CDC27在T-LBL裸鼠皮下模型中可通过激活STAT5调控PD-L1表达。全文结论1.CDC27在T-LBL患者中存在基因突变,其突变与不良预后有关。2.CDC27在T-LBL肿瘤组织中蛋白表达升高,CDC27高表达与较差的Ann Arbor分期以及不良预后有关。3.CDC27在T-LBL中发挥癌基因作用,促进其恶性生物学行为。4.CDC27可通过激活STAT5/PD-L1通路促进T-LBL发生发展。