根据世界卫生组织（WHO）2019年的估计,在纳入统计的183个国家中,恶性肿瘤是其中112个国家70岁之前人群的第一或第二大死因,在另外23个国家中排名第三或第四。癌症作为主要死亡原因的地位日益突出。最近发布的全球癌症统计显示,2020年估计发生了1930万新的癌症病例（不包括黑色素瘤和皮肤癌）和近1000万癌症相关死亡病例（不包括黑色素瘤和皮肤癌）。女性乳腺癌已超过肺癌成为最常见的癌症,估计有230万新发病例（11.7%）,紧随其后的是肺癌（11.4%）、结直肠癌（10.0%）、前列腺癌（7.3%）和胃癌（5.6%）。肺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因,估计约有180万人死亡（18%）,其次是结直肠癌（9.4%）、肝癌（8.3%）、胃癌（7.7%）和女性乳腺癌（6.9%）。肺癌根据其病理学可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）,后者占所有肺癌病例的80%。目前,NSCLC的标准疗法包括手术切除,铂类双重化疗和靶向治疗。尽管在过去几十年肺癌的诊断和治疗策略有所改善,但I期肺癌的诊断率仅为15%,晚期肺癌的5年生存率低于20%。因此,为提高肺癌患者的预后,我们迫切需要确定更有效的早期诊断和预后预测标志物,并寻找新的治疗靶点。CircRNA是一类共价闭合的RNA,于1976年在RNA病毒和类病毒中发现,并且普遍存在于许多物种之中。1979年,研究人员发现circ RNA是由前m RNA（pre-m RNA）的反向剪接产生的,其中基因3’末端的外显子与5’末端的外显子反向剪接。在之后的几十年中,它们一直被认为是拼接错误的产物。然而,在过去的十年中,随着实验和高通量测序等技术的进步,研究人员在新一代测序（NGS）技术和各种生物信息学方法的帮助下,越来越关注circ RNA,circ RNA的生物学产生、特征和功能变得越来越清晰。许多研究表明,circ RNA能够作为微小RNA（micro RNA,miRNA）和RNA结合蛋白（RBPs）的分子“海绵”。此外,circ RNA还可以调节下游基因的转录和表达。与其它非编码RNA类似,circ RNA具有物种特异性并且广泛存在于绝大多数人体组织和体液中。例如,circ RNA HIPK3（circ-HIPK3）被证明广泛存在于人体的许多组织中（脑、结肠、心脏、肝脏、肺和胃）,并可作为相关器官肿瘤预后的生物标志物。而与其它非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）相比,circ RNA表达更加稳定、序列更为保守。这些特征表明,circ RNA可能在人体生理和病理过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明,肺癌患者的组织和血浆中存在许多差异表达的circ RNA,可能作为肺癌发生发展的重要调控因素,提示circ RNAs可为肺癌的诊断和治疗提供潜在的靶点。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一种非编码小RNA,在基因表达的转录后调控中发挥重要作用,与m RNA的特定位点结合以防止其翻译或促进其降解。研究表明circ RNA在其环状序列上含有多个miRNA反应元件（micro RNA response elements,MRE）。因此,circ RNA具有作为天然miRNA“海绵”的潜力。circ RNA能够通过从其靶基因中扩增和释放miRNA来调节下游基因表达。研究表明circ RNAs-miRNA的“海绵”功能参与多种疾病的发生和发展,包括肿瘤、心血管疾病、神经疾病和发育疾病,特别是肿瘤的侵袭和转移。我们首先通过GEO公共表达谱数据集分析肺腺癌组织中的cic RNA,并选择显著低表达的锌指MYM型4circ RNA（circ RNA zinc finger MYM-type containing4,circZMYM4）用于进一步分析。应用生物信息学技术预测了circZMYM4和miR-587存在结合序列,并筛选能与miR-587相互作用的基因ODAM（odontogenic ameloblast-associated protein,牙源性成釉细胞相关蛋白）。据报道,miR-587在NSCLC组织中表达上调,并且与NSCLC患者的预后相关。通过TCGA数据库分析显示ODAM与肺腺癌的预后相关。因此,我们推测circZMYM4可能通过miR-587/ODAM来促进肺腺癌的发生和发展,但其具体的作用及分子机制尚不清楚。为了明确circZMYM4在肺腺癌发生、发展及预后中的作用和分子机制,本研究拟从以下四个方面进行分析:第一部分:circZMYM4在肺腺癌组织中的表达及对细胞生物学行为的影响;第二部分:circZMYM4对肺腺癌裸鼠移植肿瘤生长的影响;第三部分:circZMYM4/miR-587/ODAM轴的筛选与验证及其在肺腺癌中的作用研究;第四部分:ODAM在肺腺癌肿瘤组织中的表达及临床意义。我们采用了生物信息学、分子生物学实验手段,结合癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）、GEO等公共数据库分析肺腺癌的表达图谱,并利用体内、体外实验研究了circZMYM4对肺腺癌的肿瘤增殖、侵袭、迁移及克隆形成等生物学行为方面的影响。利用生物信息学工具预测miR-587与circZMYM4和ODAM存在结合关系,并使用荧光霉素报告基因测定进行确认。进一步利用功能回补实验证实了circZMYM4通过“海绵”miR-587发挥其抗癌作用,而miR-587通过靶向ODAM促进肺腺癌进展。总之,通过以上方法和研究结果我们发现了一种新的肺腺癌相关的circ RNA-circZMYM4,通过“海绵”miR-587,并通过调控ODAM表达抑制肺腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。我们进一步研究了circZMYM4/miR-587/ODAM网络,以进一步了解circZMYM4在肺腺癌中的作用机制,以期待circZMYM4未来可作为一种肺腺癌诊断、治疗的新生物标志物。第一部分CircZMYM4在肺腺癌中的表达及其对细胞生物学行为的影响目的:明确circZMYM4在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞的生物学行为的影响。方法:1.本研究首先通过GEO数据库下载肺腺癌circ RNA表达谱芯片GSE158695（肺腺癌组织及癌旁组织3例）,利用R语言进行数据处理和热图绘制。在低表达的circ RNA中挑选出差异表达最明显的circZMYM4（hsacirc0011536）。2.收集8例肺腺癌患者的肿瘤组织和对应瘤旁标本组织,采用q RT-PCR方法来检测circZMYM4在肺腺癌肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平。3.通过体外培养正常支气管上皮细胞16HBE和肺腺癌细胞系H1299、H1437、A549、H1975、PC9,q RT-PCR法检测circZMYM4在肺腺癌细胞中的表达水平。4.利用细胞转染技术对肺腺癌细胞系H1299、H1437进行过表达circZMYM4转染,采用q RT-PCR法检测转染效率,进一步分析过表达circZMYM4对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭以及克隆形成能力的影响。结果1.circZMYM4在肺腺癌组织中的表达量显著低于正常组织（P＜0.001）。2.与正常支气管上皮细胞16HBE细胞相比,肺腺癌细胞系H1299、H1437、A549、H1975、PC9中circZMYM4表达水平均显著降低（P＜0.05）。进一步的比较显示,circZMYM4在H1299、H1437细胞系中的表达水平相对较低,故把它们作为后续实验研究的对象。3.与对照组相比,在肺腺癌细胞系H1299和H1437中过表达circZMYM4后,细胞增殖、DNA合成和克隆形成能力显著降低;同时细胞的侵袭和迁移能力也受到显著抑制。结论CircZMYM4在肺腺癌肿瘤组织和细胞中显著低表达。过表达circZMYM4可抑制肺腺癌肿瘤细胞的增殖、DNA合成和克隆形成能力、迁移和侵袭能力。第二部分CircZMYM4对肺腺癌裸鼠移植肿瘤生长的影响目的应用裸鼠荷瘤模型研究过表达circZMYM4在体内对肺腺癌肿瘤增殖能力的影响。方法1.建立肺腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型。将裸鼠分为NC组:接种转染对照质粒的H1299细胞;OE-circZMYM4组:接种转染circZMYM4过表达质粒的H1299细胞。2.观察裸鼠皮下移植瘤生长速度,每一周进行移植瘤长度和宽度测量并计算出肿瘤的体积大小,绘制移植瘤生长曲线。5周后处死小鼠,取出瘤体,去除表面脂肪并称重。3.免疫组化法检测瘤体组织中Ki-67的表达。结果1.与对照组相比,过表达circZMYM4组肿瘤的增殖速度减慢,肿瘤体积减小。2.与对照组相比,过表达circZMYM4组细胞增殖的标记物Ki-67的表达减少。结论通过裸鼠肺腺癌移植瘤的实验证实过表达circZMYM4会抑制移植瘤体的生长。第三部分CircZMYM4/miR-587/ODAM轴的筛选与验证及其在肺腺癌进展中的作用研究目的筛选并鉴定能够与circZMYM4结合的miRNA,进一步筛选其下游调控通路,探索circZMYM4/miR-587/ODAM调控网络在肺腺癌进展过程中的机制。方法1.通过生物信息预测方法和双荧光素酶报告试验,筛选并验证circZMYM4靶向调控miR-587,miR-587靶向调控ODAM。2.利用q RT-PCR法验证circZMYM4对miR-587的调控,q RT-PCR法和Westrn blot法验证miR-587靶向调控ODAM。3.功能回补实验研究了circZMYM4/miR-587/ODAM调控网络对肺腺癌细胞增殖、迁移等恶性生物学行为的作用。结果1.生物信息学分析和细胞学实验表明circZMYM4与miR-587序列存在结合位点,可能进行靶向调控。2.进一步通过生物信息学分析和细胞学实验证实了ODAM的3’UTR与miR-587存在结合位点。miR-587和ODAM存在靶向调控关系。3.q RT-PCR法证实了肺腺癌细胞中circZMYM4表达与miR-587表达呈负相关,同时ODAM表达与miR-587表达呈负相关,而circZMYM4表达与ODAM表达呈正相关（P＜0.01）。4.双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比共转染miR-587 mimics与circZMYM4野生型质粒荧光素酶活性明显下降（P＜0.01）;而转染miR-587mimics与circZMYM4突变型质粒荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。与对照组相比共转染miR-587 mimics与ODAM野生型质粒荧光素酶活性明显下降（P＜0.01）;而转染miR-587 mimics与ODAM突变型质粒荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。5.功能回补实验证实上调circZMYM4表达能明显抑制肺腺癌细胞H1299的增殖、克隆成形能力和迁移侵袭能力,而上调miR-587表达或者下调ODAM表达能抵消上调circZMYM4表达的部分抑制作用。结论肺腺癌细胞中circZMYM4过表达可通过竞争性结合miR-587抑制miR-587表达,进而促进ODAM的表达。circZMYM4/miR-587/ODAM轴影响肺腺癌细胞的增殖、克隆能力和迁移侵袭。第四部分ODAM在肺腺癌肿瘤组织中的表达及临床意义目的明确ODAM在肺腺癌组织中的表达和临床意义。方法1.利用TCGA数据库和GEO数据库来分析ODAM在肺腺癌组织中的表达水平;并进一步分析ODMA表达水平和肺腺癌患者预后的关系。2.应用免疫印迹法（Western-blot）进行检测ODAM蛋白在肺腺癌组织中的表达。3.利用肺腺癌组织芯片进一步来研究ODAM蛋白的表达与肺腺癌患者预后的关系。结果1.通过TCGA和GEO的数据分析发现ODAM在肺腺癌肿瘤组织中存在显著异常的表达谱,与癌旁组织相比,肺腺癌组织中ODAM呈现低表达;依据肺腺癌组织中ODAM的表达水平将肺腺癌患者分为ODAM高表达组和ODAM低表达组,进一步生存分析发现ODAM低表达的肺腺癌患者生存期短于ODAM高表达的肺腺癌患者。2.利用肺腺癌组织及癌旁组织芯片队列,证实与癌旁组织相比,肺腺癌肿瘤组织中ODAM在蛋白水平呈低表达,生存分析发现ODAM的低表达肺腺癌患者的总生存率和疾病无进展存活率降低,ODAM可能是肺腺癌潜在的预后标志物。结论ODAM在肺腺癌中低表达,并且与肺癌患者的临床预后密切相关。全文结论:（1）circZMYM4在肺腺癌肿瘤组织中和细胞中显著低表达;（2）过表达circZMYM4可抑制肺腺癌肿瘤细胞的增殖、DNA合成和克隆形成能力、迁移和侵袭能力;（3）circZMYM4的低表达可能导致肺腺癌患者差的预后;（4）circZMYM4在肺腺癌中的低表达可能使miR-587表达上调进而下调ODMA的表达,促进肺腺癌肿瘤细胞的DNA合成和克隆形成、增殖、侵袭和迁移。总之,circZMYM4/miR-587/ODAM调控网络在肺腺癌的发生发展中起到了重要的作用,有可能成为肺腺癌诊断和治疗提供新的靶点。