研究背景:颌骨的外伤、肿瘤或颌面外科的手术常常会造成牙槽骨的大面积缺损。虽然牙槽骨的再生能力良好,然而一旦牙槽骨缺损达到标准骨缺损大小,成骨效果往往会不理想。那么,很多情况下,临床上对骨移植材料就有了较高的需求,特别是在口腔颌面外科及口腔种植手术中,骨移植材料被广泛应用。在目前的临床应用中,颗粒状异种骨在牙槽骨缺损骨增量的应用较为广泛。然而,颗粒状骨移植材料在临床应用中呈现出了一些缺点和不足之处,如结构松散,在受压后易塌陷等。近来一项动物实验发现,由于伤口关闭和组织瓣的缝合引起了颗粒状骨移植材料部分塌陷和移位,相反块状骨移植位点塌陷则更少。研究者得出的结论是相比颗粒状移植物在伤口关闭和组织瓣缝合后块状骨移植材料的外形保持能力更佳。块状骨移植材料可以作为颗粒状骨移植材料的有效替代物。目前,仅有少量的文献报道了异种和同种异体块状骨移植材料的研究。有一篇临床文献报道了脱蛋白块状小牛骨(DBBM)应用于12例患者种植前水平骨缺损的增量。经过9-10个月骨生长愈合后,其中11例病人牙槽骨宽度允许种植体植入理想的三维位置,结论是块状骨在水平向上的骨增量有效。这个结果和一个临床前的实验在水平方向上使用脱蛋白块状小牛骨(DBBM)牙槽嵴水平向增宽的测量结果相似。实际上,引导骨组织再生术(GBR)3个月后,所有的位点均适合种植体植入。然而,块状骨移植材料内部成骨效能受限,特别是较大的骨缺损。对于异种骨块移植,重组异种骨是目前研究的热点,即为了增加骨诱导成骨的能力,将异种骨与促进骨生长的因子或细胞等结合。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)国内外研究报道其可以促进骨改进及愈合的生长因子,在骨折早期骨修复时,对骨的再生修复起重要作用,通过促进多功能间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞或成软骨细胞。目前的研究报道中具有临床应用潜力的是重组人BMP-2和BMP-7,这两种生长因子在脊柱融合、骨缺损等的治疗中较早的应用。有学者报道制成了新型的复合骨移植材料即:使用BMP-2缓释载体负载于猪异种骨,用于治疗骨缺损。这种复合材料与单纯猪异种骨相比表现出更好的局部骨生成能力,其中央区成骨也比较显著,这项研究报道表明BMP-2具有良好成骨效应。重组人BMP(rhBMP)-7主要用于治疗骨折不愈合,多数研究报道中其也被证实有助于骨生成和骨传导。重组人BMP-2在2002年被美国食品与药品协会批准应用于脊柱融合手术。但是,尽管重组BMP-2表现出了良好的促进成骨作用,最近在脊柱修复手术有报道中对其安全性提出了质疑,报道中提到副用作有:术后形成血肿,软组织水肿,脊柱骨的溶解,异位成骨和致癌性。此外,气道水肿在应用人重组BMP-2的脊柱外科手术中也被观察到,这促使美国食品与药品协会(FDA)提醒在使用人重组BMP-2中应引起注意。骨愈合在体内是一个复杂的过程,包含大量间充质细胞的聚集,然后是高代谢水平成骨细胞和巨噬细胞的分化,随后是血管和编织骨的形成。损伤位点前体细胞的聚集合血管生成。杜冰等人在纳米羟基磷灰石珊瑚骨块对临界慢性下颌骨缺损修复的影响研究中发现:虽然在骨块中央能发现的新生骨很少,但负载血管内皮生长因子纳米羟基磷灰石骨块被发现可以促进骨块新骨生成。我们试图寻找一种新的物质能够提高小牛骨块的骨再生能力。我们注意到一些研究报道了特定的羟固醇可以促进多潜能骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化。Kha HT和Richardson报道特定天然存在的羟固醇有很强的促进骨再生的特性。特定羟固醇如20(S)-hydroxycholesterol(简称:20S)可以激发小鼠M2-10B4(简称:M2)骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化,通过检测分化标记物如碱性磷酸酶活性,骨钙蛋白的表达,证实特定强固醇具有很强的促进骨生成作用。羟基胆固醇,又名羟固醇,是胆固醇27碳氧化产物大家族中的组成部分,这些分子存在于血液循环系统和人的组织中。内源性羟基胆固醇生成的方式多种多样,其中包括胆固醇的自氧化反应,脂质的过氧化反应和酶化反应。通过日常饮食,可以获得外源性的羟基胆固醇。羟基胆固醇在多种代谢活动中发挥生物活性,包括调节胆固醇平衡,影响动脉粥样硬化的形成,鞘脂类代谢血小板的凝聚和细胞凋亡。此外,羟固醇也可能来源于饮食摄入。天然的羟固醇最强促进成骨作用的是20(S)羟固醇(简称20S),作用于多潜能间充质干细胞可以促进其向成骨细胞分化。然而,和本研究相关的是特定的羟基胆固醇被证实具有促进成骨活性的功能。在小鼠细胞的研究报道中,羟固醇在调节骨生成活动的机制是活化刺猬信号通路(hedgehog signaling pathway)。多种天然存在的羟基胆固醇类似物,如22(R)-羟基胆固醇,20(S)-羟基胆固醇和22(S)-羟基胆固醇,在小鼠多潜能骨髓间充质干细胞系M2-10B4和原始小鼠间充质干细胞中的都被实验证实具有促进成骨分化的能力。Akishige Hokugo等人将20S负载至一种水凝胶上植入大鼠的颅顶骨缺损,结果显示负载20S的水凝胶相比对照组对大鼠颅顶骨缺损的修复有明显的促进作用。因此,将负载特定羟固醇如20S块状骨支架植入比格犬下颌骨慢性骨缺损中可能是促进早期成骨进而影响骨组织改建的一种有效的方法。基于此,我们提出以下假设:(1)含胶原小牛骨块(CBBM)可以作为标准骨缺损的理想移植支架材料。(2)含胶原小牛骨块(CBBM)作为一种载体局部负载20(S)羟固醇(简称:20S)在骨愈合早期阶段可以促进新骨生成。目的:1、研究含胶原小牛骨块(CBBM)移植材料的成骨效能。2、研究20(S)-羟固醇(20S)对含胶原小牛骨块修复临界慢性下颌骨缺损的促进骨组织新生作用。方法:1、室温下在超净工作台上将20(S)-羟固醇溶解在无水乙醇缓冲液中,配制成0.3mg/ml 20S/无水乙醇溶液。在无菌培养皿上将16块CBBM整齐摆放,稍后将1ml 20S/无水乙醇溶液注射于骨块内(3mg 20S/CBBM),此负载方式属于非共价的物理吸附20S;将另外16块含胶原小牛骨块注射等量无水乙醇。静置24小时后低温无菌下保存。2.负载20S的含胶原小牛骨块(CBBM)修复临界慢性下颌骨缺损。动物实验分为实验组:20S/CBBM组和对照组:CBBM组。每组设4周为观察时间点。每只动物随机标号,并于每侧下颌骨建立2个标准化临界慢性骨缺损,采用半口对照设计,随机将20S/CBBM植于一侧缺损中,将CBBM植于另一侧。(1)建立临界慢性下颌骨缺损模型。建模手术过程分为2个步骤。首先,采用分根法在全麻下拔除全麻下颌双侧第2至第4前磨牙以及第1和第2磨牙(P2-M2),拔牙过程中充分保护颊侧骨板的完整性。然后,从牙槽嵴顶至第3磨牙近中作角形切口,纵向切开粘骨膜、翻瓣,在0.9%无菌生理盐水充分冷却下,在比格犬每侧下颌骨的颊侧分别建立2个标准箱状骨缺损(n=8),尺寸为:颊舌向距离为5mm,牙合龈向距离10mm,近远中向距离为10mm,缺损与缺失之间距为5mm:舌侧骨板完整保留,复位粘骨膜瓣,严密缝合。第1次手术后第4周,将比格犬再次全麻,再次沿牙槽嵴顶至第3磨牙近中作角形切开、分离粘骨膜瓣,重新塑形箱型骨缺损,对照设计为:半口对照,分别并随机于骨缺损内植入8块20S/CBBM和8块CBBM组,对切口进行减账,复位粘骨膜瓣,严密缝合,保持创口清洁。(2)骨块移植手术后生长愈合4周将动物按伦理学要求处死,取骨标本,经一系列处理后,对骨组织标本组织学及组织形态学观察并行定量分析。首先是脱钙切片的制作,随后将标本HE染色。观察4周骨缺损骨移植中区成骨细胞和新生骨组织的面积比,IPP软件对HE染色的标本进行测量,对照组和实验组样本量均为8(n=8)。租后是硬组织切片的制作,因比格犬在处死前进行了四环素和钙黄绿素荧光注射,不同荧光标记时间点的骨块可以通过共聚焦显微镜观察不痛荧光的分布就观察到新骨生成情况情况,并使用IPP图像分析软件对钙化新生骨面积进行测量,从而得出新生骨面积比,对照组和实验组的样本量均为8(n=8)。3.采用SPSS 18.0统计分析软件,统计学分析HE染色脱钙切片的新生骨面积百分比、硬组织切片荧光标记的钙化新生骨面积比。图像分析软件处理图像以平均值±标准差(±S)表示测量结果,首先,正态分布和方差齐性检验对组织形态学测量所得的数据进行分析检验。若测量所得的数据符合正态分布且方差齐,那么就采用两独立样本t检验对整体均数进行比较;若测量所得的数据不是正态分布或方差检验不齐,那么就使用两独立样本t’检验对整体均数进行比较。假设检验为双侧检验,将检验水准设定为P=0.05。如果P>0.05,数据差异被认为无统计学意义;反之,如果P<0.05,数据差异被认为有统计学意义。结果:(1)实验动物及标本的大体观察结果:术中及术后4只比格犬饮食、活动均正常,实验动物均无死亡,双侧下颌骨缺损处骨移植术区未见红肿、化脓等愈合并发症,所有骨移植处骨块均未见松动脱落等并发症;骨移植愈合4周后,取材的标本可见移植骨区伤口生长愈合均良好,骨生长亦良好,移植骨块与宿主骨交界区边界清晰,结合紧密。(2)HE脱钙切片组织学和形态学观察及定量分析近宿主骨与骨块交界处,4周时CBBM在骨移植区显微镜下见稀疏骨小梁及与其伴行的血管,这些结构沿着支架向移植骨块网孔的内部生长,移植骨块内部及中央区的新生骨和血管与交界面处的新生骨及血管结构相比,前者明显较少,越靠近移植骨块中央新生骨组织长入越少,炎症细胞浸润现象在镜下未观察到。在新生骨结构中还可见呈多形性的成骨细胞沿着脱钙的支架网孔间隙呈线形排列,增生活跃。而20S/CBBM组的新生骨组织结构、分布与CBBM组相似,新生骨组织区域面积相对较多。(3)组织形态学测量结果显示:CBBM组和20S/CBBM组的新生骨面积百分比分别为8.73%±3.46%和12.34%±3.86%。统计数据经检验符合正态分布,Levene’S test检验最终的检验结果为F=0.673,方差齐;接着进行两独立样本t检验,最终检验结果为:t=2.213,P=0.042<0.05,认为CBBM组和20S/CBBM的新生骨面积百分比有统计学差异。(4)硬组织切片荧光显微镜及组织形态的观察及测量结果新生骨螯合不同的荧光剂后在荧光显微镜下则会显示出不同的颜色,螯和钙黄绿素会显示出绿色荧光,而盐酸四环素在镜下会显示出黄色荧光,CBBM组生长4周后,镜下硬组织切片绿色钙黄绿素荧光呈网状分布,支架周边是其主要分布所在,尤其是近宿主骨与移植骨块界面交界区域,然而骨块内部仅可见少量绿色荧光且分布不均匀。在近宿主骨与移植骨块交界面处可见少量四环素荧光呈黄色条带状分布;而20S/CBBM组生长愈合4周后,镜下绿色的钙黄绿素荧光带相比CBBM组要较多,且其骨块内部明显可见绿色荧光,但分布不均,镜下见20S/CBBM绿色荧光带不仅只位于移植骨块材料的表面,还可见部分荧光进入到了移植骨材料的网孔间隙内部。无论是CBBM组还是20S/CBBM组,移植骨块生长愈合4周后外部形态仍然比较规则,未见明显吸收或塌陷发生。组织形态学测量结果显示:CBBM组和负载20S/CBBM组的钙化新生骨面积比分别为0.79%±0.23%和1.08%±0.27%,经统计学检验,所得实验数据符合正态分布,Levene’S test检验后表明方差齐;两独立样本t检验最终结果为:t=2.369,P=0.045<0.05,差异有统计学意义。结论:1.胶原骨块(CBBM)的三维网孔结构在比格犬下颌临界慢性骨缺损修复中可使新生骨的一系列细胞通过网孔结构进入其内部,随后形成血管和新生骨组织,实验表明CBBM表现出了良好的生物相容性和骨传导性,实验证明其具有较高的成骨效能。2.负载20(S)-hydroxycholesterol能在胶原骨块(CBBM)移植骨愈合早期促进新骨钙化及新骨形成。