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背景及目的:肝脏疾病是全世界日益严重的死亡原因。目前世界上高达25%的人口患有肝脏疾病或存在肝脏疾病的危险因素,包括病毒感染,酒精滥用和非酒精性肝炎(NASH)等。这些危险因素的普遍存在使得原发性肝癌的发病率逐年上升,最新统计显示原发性肝癌每年可引起超过80万人死亡。肝脏缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion,I/R),是肝脏肿瘤切除及肝移植手术最常见的组织损伤之一。无菌性炎症与肝细胞死亡之间复杂的相互作用决定了I/R后肝脏损伤严重程度。胱天蛋白酶募集域蛋白6(CARD6)在NF-κB激活中起着重要作用,能够调控炎症反应,但是其是否参与肝脏I/R损伤的调节尚不清楚。本研究拟阐明CARD6是否参与肝脏缺血/再灌注损伤病理生理过程的调控,并探讨其潜在的分子机制。方法:第一部分:分别在人体、小鼠肝脏组织、细胞样品中,检测CARD6基因在缺血/再灌注损伤后的表达情况。我们采用Quantitative PCR(q PCR)及Western Blot检测了CARD6在人肝移植的样品、小鼠肝脏缺血/再灌注损伤模型(Hepatic ischemia-reperfusion injury model,Hepatic I/R)和小鼠原代肝细胞缺氧/复氧模型(Hepatocyte hypoxia/reoxygenation,Hepatocyte H/R)中的表达变化情况。第二部分:构建CARD6肝脏特异性敲除(Hepatocyte-specific CARD6knockout,Card6-HKO)和过表达(Hepatocyte-specific CARD6 transgenic,Card6-HTG)及相应的对照组小鼠,在体建立肝I/R模型,分离原代肝细胞建立体外Hepatocyte H/R模型,行表型相关分析。在体实验,选用8周龄,雄性,Card6-HKO和Card6-HTG及相应的对照组小鼠,随机分入假手术组(Sham组)、手术组(I/R组),在对应的时间点经眶静脉采血,分离血清,检测血清中的肝酶(ALT,AST)的水平,炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1及CXCL-1)的水平。剪开腹腔,取小鼠肝脏拍照,然后一部分置于甲醛溶液中固定作为病理分析用,另一部分置于-80℃作为分子生物学检测用。通过H&E染色、病理组织学检测的方法来评价小鼠肝脏缺血/再灌注损伤的严重程度。进一步,通过Quantitative PCR,Western Blot检测小鼠肝脏组织中与炎症和细胞凋亡相关基因的m RNA和蛋白表达水平,流式细胞术检测肝脏中非实质细胞炎性浸润情况。体外实验,选择6-8周龄,雄性,Card6-HKO和Card6-HTG及相应的对照组小鼠,分离原代肝细胞,建立Hepatocyte H/R模型,取细胞培养的上清液,检测炎症因子的水平,乳酸脱氢酶(LDH)毒性试验检测原代肝细胞损伤情况,Western Blot检测损伤后原代肝细胞炎症和细胞凋亡相关基因的蛋白的表达水平。第三部分:明确并验证肝脏缺血/再灌注损伤中CARD6发挥调控功能的机制。Western Blot检测Card6-HKO和Card6-HTG及相应对照组小鼠体内和体外肝脏缺血/再灌注模型中JNK/P38信号通路的变化,并锁定上游的关键调控激酶ASK1。行免疫共沉淀和GST-Pulldown确认CARD6与ASK1之间是否存在直接相互作用。进一步通过截短CARD6和ASK1序列,来确定CARD6和ASK1之间的可能的作用位点。第四部分:采用Ad-CARD6以及Ad-CARD6突变的腺病毒在体转染小鼠,建立Hepatic I/R模型,行表型相关分析,明确CARD6基因通过与ASK1相互作用从而调控肝脏缺血/再灌注损伤。在分别转染不同剂量腺病毒的小鼠原代肝细胞Hepatocyte H/R模型中和分别注射腺病毒WT小鼠构建的Hepatic I/R模型中,通过Western Blot检测ASK1的表达变化。分离血清,检测血清中的肝酶的水平(ALT,AST)评价肝脏功能受损情况;并取肝脏组织,行H&E病理染色来评价小鼠肝脏组织学损伤的严重程度。进一步,通过Western Blot检测缺血/再灌注损伤后小鼠肝脏组织中JNK/P38信号通路的变化。结果:第一部分:对比正常人体肝脏组织,肝移植的肝脏组织中CARD6的表达明显下调。在体Hepatic I/R和体外Hepatocyte H/R模型中,CARD6的m RNA和蛋白表达水平随缺血/再灌注或缺氧/复氧时间延长而逐渐下降。第二部分:在Card6-HKO和Card6-HTG及相应的对照组小鼠的Hepatic I/R和原代肝细胞的Hepatocyte H/R模型中:1)在假手术组,血清肝酶和肝脏组织学损伤没有显著差异。然而,缺血/再灌注损伤后,Card6-HKO小鼠血清肝酶水平(ALT,AST)明显高于对照组小鼠,从小鼠肝脏大体外观和H&E病理染色结果观察到Card6-HKO小鼠肝脏组织学损伤明显比对照组重。而Card6-HTG与其对照组相比,肝酶水平和肝脏组织学损伤程度明显改善。2)小鼠血清和原代细胞上清的炎症因子测定、流式细胞术、免疫荧光染色、q PCR和Western Blot结果提示,与对照组相比,Card6-HKO小鼠I/R损伤后血清炎症因子水平明显上调,肝脏组织中炎症细胞浸润和肝脏细胞死亡明显增加。Card6-HTG小鼠血清炎症因子水平明显受抑制,肝脏组织中炎症浸润和肝脏细胞死亡明显改善。第三部分:1)Western Blot分析JNK/P38信号通路发现,在肝脏缺血/再灌注损伤后,CARD6基因敲除可以促进ASK1的磷酸化激活,明显促进JNK/P38信号通路的激活,而CARD6过表达则明显抑制JNK/P38信号通路的激活。2)Co-IP及GST pulldown检测证实CARD6与ASK1能够相互作用。3)多个位点截短CARD6基因序列提示,只有CARD6的280-481氨基酸段可以与ASK1相互作用,多个位点截短ASK1基因序列提示,ASK1的催化结合域能够与CARD6相互作用。4)Co-IP进一步证实在CARD6的突变体(氨基酸281-480缺失)失去了与ASK1相互作用的能力。第四部分:在WT小鼠Hepatic I/R模型中过表达CARD6和Card6-m(281-480)基因后,我们观察到:1)过表达CARD6以剂量依赖的方式抑制ASK1的磷酸化,而CARD6突变体失去了抑制ASK1磷酸化的作用。2)CARD6基因过表达能明显改善缺血/再灌注后肝脏的损伤,CARD6突变体未能有效防止缺血/再灌注后肝脏的损伤。3)小鼠肝脏过表达CARD6突变体后,无法如CARD6一样有效抑制JNK/P38信号通路的激活,不能改善炎症浸润和肝脏细胞死亡情况。结论:通过小鼠Hepatic I/R模型及原代肝细胞Hepatocyte H/R模型模拟肝脏缺血/再灌注损伤的过程,我们发现在肝脏缺血/再灌注损伤中CARD6起到重要保护作用,其可能的作用机制是CARD6通过与ASK1直接相互作用,抑制ASK1/JNK/P38信号通路的激活,改善肝脏缺血/再灌注损伤后的炎症浸润和肝细胞死亡。